GLUT1介導EF-24抑制非小細胞肺癌細胞生長的機制研究.pdf

1、肺癌(lung cancer)是一種嚴重危害人類生命健康的主要惡性腫瘤，在全球范圍內其死亡率位列惡性腫瘤首位，并且近年來其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢。肺癌中以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)居多，占80％-85％，治療的手段主要是手術、放療、化療和分子靶向治療為主的綜合治療。NSCLC的病因尚未明確，發(fā)病機制復雜，是多種因素共同作用的結果，已有研究表明空氣污染、吸煙等環(huán)境因素以及遺傳因素

2、與其發(fā)病有關。近年來，國內外學者從不同角度探討NSCLC的發(fā)生發(fā)展機制，發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌的癌細胞增殖能力增強，這一點與正常細胞不同，而這一特性的獲得與癌細胞對葡萄糖的攝取以及糖酵解代謝的增強有關。葡萄糖攝取量的增加和糖酵解能量代謝的增強不僅可導致腫瘤細胞的惡性轉化、浸潤和轉移，而且還造成后期對放療、化療等治療方法的抵抗，所以傳統(tǒng)的腫瘤治療方式很難達到理想的效果。
　　葡萄糖轉運蛋白(glucose transport protei

3、n，GLUT)是嵌入在細胞膜上，轉運葡萄糖的載體蛋白，在正常生理條件下葡萄糖需借助GLUT而被細胞所攝取。該家族的主要成員葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter protein1，GLUT1)是細胞糖代謝的主要限速蛋白，是體內分布最廣的葡萄糖轉運蛋白，幾乎在所有的腫瘤組織中均存在過度表達。GLUT1的過度表達使腫瘤細胞在缺血、缺氧的情況下得以高效攝取和利用葡萄糖，從而獲得更多的能量供應，以維持腫瘤細胞快速生長。研究表明

4、NSCLC細胞的惡性增殖和侵襲轉移性能與GLUT1的過度表達密切相關，而且與腫瘤的大小、分化程度、轉移呈正相關。
　　姜黃素(curcumin)是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術等的根或莖中提取的一種有效植物多酚，它具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎癥反應的多重生物學效應。2004年Adams等人在姜黃素分子結構的基礎上，發(fā)現(xiàn)了一百多種姜黃素衍生物，它們大部分都具有抗腫瘤的作用機制，其中聯(lián)苯二氟酮(Diphenyl difluoroket

5、one，EF-24)的作用最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)EF-24對大多數(shù)惡性腫瘤細胞株，與胃癌、腸癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等相關，都有明顯的抑制作用，其效果至少是姜黃素的10余倍。EF-24在治療前列腺癌和乳腺癌時可以直接抑制低氧誘導因子-1α(hypoxia inducefactor-1α，HIF-1α)的轉錄活性，從而使腫瘤細胞中HIF-1α介導的調節(jié)葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的相關基因上調，促使腫瘤在低氧時采用糖酵解途徑。并且EF-

6、24在卵巢癌細胞研究中可以抑制GLUT1介導的代謝，從而抑制腫瘤侵襲、轉移。
　　鑒于此，我們設想以GLUT1為切入點，利用Western-blotting、RT-PCR檢測EF-24對非小細胞肺癌細胞GLUT1蛋白及基因的影響;觀察EF-24在不同濃度對非小細胞肺癌細胞增殖活性的影響;利用Transwell細胞侵襲實驗以及建立裸鼠皮下移植瘤的動物模型，通過體內和體外實驗觀察EF-24對非小細胞肺癌細胞侵襲和轉移能力的影響;通過觀

7、察EF-24在細胞水平、機體水平對非小細胞肺癌細胞轉移和增殖活性以及糖酵解中糖代謝和GLUT1表達的影響，研究EF-24與非小細胞肺癌細胞的增殖、轉移的關系，為有效防治非小細胞肺癌提供藥物治療的新靶點。
　　目的:
　　1.明確NSCLC患者的肺部癌組織、癌旁組織以及正常肺組織中GLUT1的轉錄水平以及翻譯水平的表達情況;
　　2.以GLUT1為切入點，不同濃度的EF-24處理NSCLC細胞系A549細胞，通過MMT實

8、驗明確EF-24對A549細胞增殖活性的影響;
　　3.研究EF-24與NSCLC的侵襲、轉移的關系，為有效防治肺癌提供藥物治療新靶點。
　　方法:
　　1.收集NSCLC患者的臨床新鮮手術組織標本，如正常組織標本、成對肺癌組織、癌旁組織。所取臨床標本經山東大學第二醫(yī)院倫理委員會審計批準。
　　2.應用蛋白印跡實驗、免疫組化的方法來明確NSCLC組織結構中GLUT1的表達情況，并結合臨床病理結果分析GLUT1的表

9、達與NSCLC臨床病理分級的關系。
　　3.利用不同濃度的EF-24處理NSCLC A549細胞系，應用RT-PCR、免疫印跡、熒光報告分析等實驗來明確GLUT1在轉錄和翻譯水平的表達情況，并結合細胞周期分析、細胞遷移實驗、體內成瘤實驗、MTT法測定細胞增殖活性等方法進一步評估此現(xiàn)象。
　　4.應用細胞轉染技術、細胞計數(shù)、檢測細胞增殖實驗的方法，通過細胞體外、裸鼠體內2種實驗來分析GLUT1對A549細胞系的生長增殖能力的影

10、響。
　　5.統(tǒng)計學分析:實驗數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行分析統(tǒng)計。符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料應用均數(shù)±標準差表示（(x)±s）。兩組之間的統(tǒng)計學比較應用t-test，多組之間等級資料的統(tǒng)計學比較采用方差分析、Tukey檢驗。P值＜0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　1.在患者肺組織標本中，通過RT-PCR、免疫印跡技術，我們發(fā)現(xiàn)與對應的癌旁組織、正常肺組織比較，肺腫瘤組織中GULT1的表達在轉錄及

11、翻譯水平均明顯上調，并與腫瘤的臨床病理分級呈正相關關系。
　　2.本研究通過在A549細胞系中轉染GLUT1 siRNA及shRNA將GLUT1基因沉默，并經細胞計數(shù)、檢測細胞的增殖實驗方法，證實了GLUT1基因的沉默能夠引起A549細胞的生長和增殖能力減低。另外，通過在裸鼠的體內實驗，A549細胞被轉染GLUT1 shRNA注射入裸鼠體內，7周后發(fā)現(xiàn)與對照組比較，腫瘤的體積明顯縮小，這進一步證實沉默GLUT1基因可以顯著抑制肺癌

12、細胞的生長。因此，我們認為GLUT1被沉默后A549細胞的生長和成瘤能力均受到顯著抑制，從而反向證明了GLUT1促進A549細胞系的生長增殖能力。
　　3.利用不同濃度EF-24處理A549細胞，通過免疫印跡技術，結果表明在A549細胞中的EF-24可以顯著減少GLUT1的表達，并且這種下降呈明顯的梯度依賴性，與EF-24的藥物濃度成正比。
　　4.通過采用不同濃度的EF-24分別處理A549細胞，檢測A549細胞中葡萄糖的

13、吸收和糖酵解的速度、觀察Transwell細胞遷移、侵襲及用MTT檢測細胞增殖能力，我們發(fā)現(xiàn)EF-24可以抑制A549細胞的糖酵解途徑及抑制A549細胞的遷移和侵襲。
　　結論:
　　1.本實驗發(fā)現(xiàn)GLUT1在非小細胞肺癌組織的表達顯著高于相鄰癌旁組織和正常的肺組織;
　　2.本研究證明EF-24可以抑制GLUT1基因在A549細胞系的表達，從而影響NSCLC細胞系A549細胞的糖酵解途徑及遷移侵襲，進而抑制NSCLC