HIF-1介導(dǎo)SCF的表達(dá)調(diào)控參與胰腺癌細(xì)胞適應(yīng)乏氧環(huán)境的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:
　　胰腺癌是一種主要來源于胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的惡性實(shí)體腫瘤。近年來胰腺癌發(fā)病率在國內(nèi)外均呈穩(wěn)固上升趨勢，每10年增加15％左右。胰腺癌是目前預(yù)后最差的消化系統(tǒng)腫瘤，五年生存率僅4％。盡管外科手術(shù)和化療有很大的改進(jìn)，但近20年來胰腺癌患者的預(yù)后并未有明顯改善。目前多項研究表明，缺氧是實(shí)體瘤中存在的一種普遍現(xiàn)象，其作為應(yīng)激原，可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一系列基因?qū)Ψρ踝鞒鰬?yīng)答反應(yīng)，從而改變腫瘤生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡抑制、腫瘤血管形

2、成、能量代謝及侵襲轉(zhuǎn)移等，使腫瘤適應(yīng)乏氧微環(huán)境，增加了臨床治療的困難。胰腺癌是一個典型的乏氧實(shí)體腫瘤，胰腺癌患者的CT檢查常表現(xiàn)為腫瘤性占位性病變的中心有缺血壞死低密度灶，并且在增強(qiáng)掃描時腫瘤壞死病灶無增強(qiáng)，提示腫瘤內(nèi)缺乏有效血管，處于缺氧狀態(tài)。因此，乏氧狀態(tài)下，對其相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制的研究，可能為胰腺癌有效治療提供新的思路。
　　在眾多參與細(xì)胞乏氧狀態(tài)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子中研究最深入的、作用最強(qiáng)的當(dāng)屬乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia ind

3、ucible factor，HIF)，其能特異性地結(jié)合于一種低氧反應(yīng)元件(hypoxia-responsive element，HRE)(5’-RCGTG-3’)調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。有研究表明，低氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)SCF的表達(dá)，SCF是一種干細(xì)胞因子，表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞的表面，在腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生等方面有重要作用。因此，我們推測胰腺癌細(xì)胞在乏氧環(huán)境下可通過HIF調(diào)節(jié)SCF的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

4、通過相關(guān)的實(shí)驗技術(shù)初步觀察胰腺癌組織中HIF-1與SCF表達(dá)相關(guān)性，驗證乏氧環(huán)境下HIF-1與SCF之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　一、胰腺癌組織中SCF與HIF-1的表達(dá)情況1.利用免疫組化方法檢測SCF、HIF-1在胰腺組織中的表達(dá)，初步分析SCF與HIF-1的表達(dá)相關(guān)性。
　　二、胰腺癌細(xì)胞中HIF-1α、c-kit的基礎(chǔ)表達(dá)情況1.本研究選擇胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、P

5、ANC-1、Capan-1為研究對象。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析不同胰腺癌細(xì)胞中c-kit(CD117)的表達(dá)，為下一步實(shí)驗選擇合適的細(xì)胞系。
　　2.靜息狀態(tài)下，提取胰腺癌細(xì)胞蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測不同胰腺癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)情況；
　　三、明確乏氧狀態(tài)下胰腺癌細(xì)胞中HIF-1與SCF表達(dá)水平及調(diào)節(jié)關(guān)系1.實(shí)驗選擇胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、PANC-1為研究對象，采用1％O2、5％CO2、94％

6、N2混合氣體對密閉培養(yǎng)箱中細(xì)胞進(jìn)行不同時間乏氧培養(yǎng)。
　　2.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和小RNA干擾技術(shù)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)后，分別應(yīng)用Western blot和RT-PCR檢測不同處理條件下胰腺癌細(xì)胞中SCF、HIF-1α、VEGF及內(nèi)參β-actin蛋白和基因的表達(dá)情況。
　　四、研究乏氧狀態(tài)下HIF-1與SCF的相互作用形式以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制1.采用染色體免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)明確HIF-1對SCF的調(diào)控形式。
　　2.

7、應(yīng)用HIF-1過表達(dá)載體、SCF基因啟動子或突變的SCF基因啟動子熒光素酶表達(dá)載體，共同轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，采用雙熒光素酶分析法，定量檢測HIF-1調(diào)控SCF基因轉(zhuǎn)錄激活的能力。
　　結(jié)果:
　　HIF-1和SCF在胰腺癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常胰腺組織，且兩者呈正相關(guān)。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示BxPC-3、PANC-1高表達(dá)c-kit，結(jié)合western blot結(jié)果選擇：BxPC-3、PANC-1作為體外實(shí)驗研究對象；經(jīng)過不同

8、時間的乏氧處理后，HIF-1與SCF蛋白在低氧環(huán)境下表達(dá)增加，并呈現(xiàn)同步性。通過RNA干擾技術(shù)沉默乏氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的表達(dá)后，westem blot及RT-PCR結(jié)果顯示，可以同時抑制SCF的mRNA與蛋白表達(dá)，而對照組沒有抑制效果；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1可以直接結(jié)合于SCF基因啟動子區(qū)的乏氧反應(yīng)原件(HRE)，并且可以上調(diào)SCF啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:
　　乏氧環(huán)境下HIF-1是調(diào)節(jié)SCF表達(dá)的關(guān)鍵