TIPE2通過上調caspase下調NF-κB促進佐劑型關節(jié)炎大鼠滑膜成纖維樣細胞凋亡.pdf

1、目的:TIPE2能夠抑制炎癥以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且TIPE2過表達能夠促進細胞的凋亡。類風濕關節(jié)炎是一種免疫多態(tài)性慢性疾病，我們應用類風濕關節(jié)炎模型大鼠佐劑型關節(jié)炎滑膜成纖維樣細胞(fibroblast-like synoviocytes of ratadjuvant arthritis，AA-FLS)，通過體外實驗分析TIPE2對死亡受體5誘導細胞凋亡的作用探討TIPE2對佐劑型關節(jié)炎發(fā)病的影響。
　　方法:通過RT-PCR、

2、熒光實時定量PCR和Western-blotting技術檢測正常大鼠滑膜成纖維樣細胞以及AA-FLS中TIPE2的表達，明確TIPE2在兩種細胞系的表達情況。進一步應用慢病毒載體穩(wěn)定轉染AA-FLS，提高TIPE2在AA-FLS的表達并應用熒光顯微鏡、RT-PCR、熒光實時定量PCR和Western-blotting技術進行鑒定。通過細胞增殖實驗以及流式細胞術應用抗DR5單鏈抗體ZF1研究TIPE2對AA-FLS細胞增殖及凋亡的影響，W

3、estern-blotting，caspase8活性檢測試劑盒檢測相關蛋白的表達，并用caspase抑制劑Z-VAD-FMK以及NF-κB抑制劑Bay同步干擾試驗組，然后通過流式細胞術檢測凋亡，研究TIPE2調控的可能機制。
　　結果:通過RT-PCR、熒光實時定量PCR和Western-blotting技術檢測發(fā)現(xiàn)TIPE2在正常大鼠滑膜成纖維樣細胞表達，在AA-FLS中表達明顯降低。通過慢病毒載體轉染技術，獲得TIPE2過表達

4、穩(wěn)定細胞株TIPE2+/+-FLS以及相應的空載組細胞株MIGR1-FLS。在TIPE2+/+-FLS穩(wěn)定細胞株中，TIPE2基因水平及蛋白水平的表達都顯著上調，TIPE家族其他成員如TIPE1，TIPE3的表達量沒有改變。ZF1刺激后，細胞生長抑制率、細胞凋亡率及DR5的表達量以及caspase8的活化量在TIPE2+/+-FLS均有明顯的增加，與MIGR1-FLS組相比，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義;并且TIPE2+/+-FLS磷酸化的

5、NF-κB和磷酸化的AKT明顯下調，與MIGR1-FLS組相比，差異顯著。在ZF1處理前60min，TIPE2+/+-FLS組給予caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理，MIGR1-FLS組給予NF-κB抑制劑Bay預處理，結果提示caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理的TIPE2+/+-FLS組凋亡率明顯降低，其凋亡率與MIGR1-FLS組相當;NF-κB抑制劑Bay預處理的MIGR1-FLS組凋亡率明顯提高。