左氧氟沙星通過上調(diào)MMP-2和MMP-13促進大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡.pdf

1、目的：探討左氧氟沙星誘導凋亡下大鼠纖維環(huán)細胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶的變化。
　　方法：酶消化法來原代培養(yǎng)大鼠的纖維環(huán)細胞，貼壁的細胞融合為單層后傳代培養(yǎng)，傳至第3代時，以不含胎牛血清以及酚紅的DMEM/HIGH GLUCOSE(1×)培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，分別按照濃度依賴和時間依賴分組實驗。濃度依賴組：按以下分組實驗，每組為6個樣本，對照組：以不含左氧氟沙星的培養(yǎng)液處理；10μg/ml組：加入濃度為10μg/ml的左氧氟沙星干預；30μ

2、g/ml組：加入濃度為30μg/ml的左氧氟沙星干預；60μg/ml組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預，90μg/ml組：加入濃度為90μg/ml的左氧氟沙星干預；120μg/ml組：加入濃度為120μg/ml的左氧氟沙星干預，以上各組細胞培養(yǎng)24小時。時間依賴組：按以下分組實驗，每組為6個樣本，對照組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預0小時；8小時組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預8小時；12小時組：加入濃

3、度為60μg/ml的左氧氟沙星干預12小時；24小時組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預24小時，36小時組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預36小時；48小時組：加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預48小時。兩組實驗分別應(yīng)用：1.應(yīng)用倒置相差顯微鏡來觀察大鼠的纖維環(huán)細胞形態(tài)；2.caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3的活性；3.細胞-膠原粘附實驗檢測細胞與I型膠原的粘附水平；4.用實時定量PCR法來

4、檢測纖維環(huán)細胞中的MMP-2和MMP-13蛋白相關(guān)基因表達情況；5.western印跡法對MMP-2蛋白和MMP-13蛋白定量檢測。
　　結(jié)果：
　　1.原代大鼠纖維環(huán)細胞多數(shù)呈現(xiàn)為長梭形，且輪廓明顯，細胞核呈現(xiàn)出圓形以及橢圓形，24～48小時后細胞可貼壁生長，8～9天細胞即進入其對數(shù)生長期。經(jīng)不同濃度左氧氟沙星干預24小時和60μg/ml的左氧氟沙星干預不同時間后觀察細胞出現(xiàn)細胞皺縮、空泡形成等凋亡征象；
　　2.用

5、caspase-3活性檢測試劑盒（碧云天）來檢測細胞中caspase-3的活性，結(jié)果顯示在濃度依次為10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml左氧氟沙星干預24小時后，細胞caspase-3的活性分別為對照組的1.81倍、3.22倍、4.23倍、5.54倍、6.56倍，差異具有統(tǒng)計學意義。在左氧氟沙星（60μg/ml）依次干預0、8、12、24、36、48小時后，細胞caspase-3的活性分別為對

6、照組的1.54倍、2.98倍、4.18倍、5.30倍、6.40倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　3.細胞與I型膠原的粘附水平實驗，濃度依賴組中各組OD值分別為對照組的0.91倍、0.83倍、0.76倍、0.70倍、0.60倍，差異具有統(tǒng)計學意義。時間依賴組中各組OD值分別為對照組的0.91倍、0.82倍、0.75倍、0.67倍、0.61倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　4.實時定量PCR檢測，在濃度依

7、賴組：MMP-2和MMP-13的2-△△Ct值分別為1.02±0.22、1.38±0.19、1.71±0.25、2.04±0.22、2.50±0.18、3.24±0.38；1.00±0.06、1.37±0.09、1.75±0.15、2.48±0.18、3.09±0.28、3.70±0.31，差異都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在時間依賴組：MMP-2的2-△△Ct值分別為1.01±0.15、1.23±0.11、1.64±0.21、2.

8、07±0.38、3.05±0.15、3.53±0.22，對照組和8h組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MMP-13的2-△△Ct值分別為1.01±0.13、1.33±0.17、1.88±0.32、2.54±0.48、3.18±0.47、3.84±0.46，對照組和8h組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組差異具有統(tǒng)計學意義（ P＜0.05）；
　　5.用western印跡法來檢測大鼠

9、纖維環(huán)細胞中MMP-2和MMP-13蛋白的表達。結(jié)果顯示：在濃度依賴組：MMP-2和MMP-13的灰度值（/GAPDH）分別為0.12±0.012、0.20±0.017、0.31±0.018、0.42±0.022、0.51±0.021、0.60±0.025；0.17±0.018、0.28±0.020、0.39±0.023、0.46±0.023、0.57±0.027、0.68±0.031。在時間依賴組：MMP-2和MMP-13的灰度值（/

10、GAPDH）分別為0.10±0.012、0.19±0.023、0.32±0.027、0.41±0.027、0.52±0.031、0.65±0.035；0.16±0.019、0.26±0.024、0.35±0.023、0.48±0.027、0.57±0.031、0.66±0.040。在濃度依賴組和時間依賴組MMP-2和MMP-13的表達量差異都具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：上述研究表明，左氧氟沙星對大鼠纖維環(huán)細胞的體外