左氧氟沙星對大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的毒性作用的體外研究.pdf

1、目的:探討喹諾酮類藥物對纖維環(huán)細(xì)胞的作用。
　　方法:這項研究的目的是以離體實驗探討左氧氟沙星對大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的影響。酶消化法來原代培養(yǎng)大鼠的纖維環(huán)細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞融合為單層時，用含有EDTA的0.2％的胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時，以不含胎牛血清以及酚紅的DMEM/F12培養(yǎng)液來培養(yǎng)細(xì)胞，按照以下濃度來分組實驗，每組為5到6個樣本。對照組:以不含左氧氟沙星的培養(yǎng)液處理;30μg/ml組:加入濃度為30μg/ml的左

2、氧氟沙星干預(yù);60μg/ml組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)，90μg/ml組:加入濃度為90μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，應(yīng)用:(1)應(yīng)用倒置相差顯微鏡來觀察大鼠的纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài);(2)用實時定量PCR的法來檢測纖維環(huán)細(xì)胞中的caspase-3蛋白和MMP-3蛋白相關(guān)基因表達(dá)情況;(3) western印跡法對caspase-3蛋白與MMP-3蛋白定量檢測;(4)應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)來進(jìn)行大鼠纖維環(huán)細(xì)胞最終

3、凋亡率的檢測。(5)運用MTS方法測定細(xì)胞增殖活力，(6) caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3的活性。大鼠的纖維環(huán)細(xì)胞分別以濃度為（0，30，60，and90μg/ml）的左氧氟沙星處理，隨即研究左氧氟沙星對其可能的細(xì)胞毒性作用。
　　結(jié)果:(1)原代大鼠的纖維環(huán)細(xì)胞多呈現(xiàn)出多角形與長梭形，且輪廓明顯，細(xì)胞核呈現(xiàn)出圓形以及橢圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見有分泌顆粒，24～48 h后細(xì)胞可貼壁生長，7～8 d細(xì)胞即進(jìn)入其對數(shù)

4、生長期，可傳6～8代。經(jīng)左氧氟沙星作用過的細(xì)胞可觀察出細(xì)胞皺縮、空泡形成等凋亡征象。(2)以流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)觀察大鼠纖維環(huán)細(xì)胞在不同濃度的左氧氟沙星處理下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示，左氧氟沙星在濃度為0μg/ml時大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率為2.70％±0.32％左氧氟沙星在濃度為30μg/ml時大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率為6.41％±0.33％，左氧氟沙星在濃度為60μg/ml時大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率為9.35％±0.64％，左氧氟沙星在濃度為90μg

5、/ml時大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率為12.83％±0.67％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。即左氧氟沙星是以濃度依賴的方式引起了大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。(3)用caspase-3活性檢測試劑盒（碧云天）來檢測細(xì)胞中caspase-3的活性，結(jié)果顯示在濃度依次為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml左氧氟沙星的條件下，細(xì)胞caspase-3的活性與對照組相比較分別提高到3.1倍、3.9倍、4.5倍、6.4倍。差異具有統(tǒng)計

6、學(xué)意義。(4)通過MTS方法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示左氧氟沙星濃度為10、20、40、80μg/ml時，細(xì)胞的活力分別降低到95.8％，91.5％，88.2％，and83.2％。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(5)用Westem blot技術(shù)來檢測大鼠纖維環(huán)細(xì)胞中的caspase-3蛋白在不同濃度的左氧氟沙星處理下的表達(dá)。其結(jié)果顯示:當(dāng)對照組、左氧氟沙星濃度依次為30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml時的灰度值(/β-actin)分別為:0

7、.19±0.03、0.28±0.02、0.39±0.02、0.49±0.03。Western blot技術(shù)檢測大鼠纖維環(huán)細(xì)胞中的MMP-3蛋白在不同濃度左氧氟沙星處理下的表達(dá)情況為表達(dá)如下，當(dāng)對照組、左氧氟沙星組的濃度依次為30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml時的灰度值(/β-actin)依次為:0.21±0.05、0.45±0.06、0.61±0.03、0.81±0.03。其組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(6)實時定量PCR檢測c

8、aspase-3蛋白的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對照組、左氧氟沙星濃度30、60、90μg/ml的相對ct值(/β-actin)分別為:0.19±0.03、0.31±0.06、0.65±0.04、0.78±0.06。實時定量PCR檢測MMP-3蛋白的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對照組、左氧氟沙星濃度30、60、90μg/ml的相對ct值(/β-actin)分別為:0.21±0.05、0.45±0.06、0.61±0.03、0.81±0.03。