氨基胍對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠肺MMP-9、MMP-13與TIMP-1失衡的影響.pdf

1、目的:肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一種慢性進(jìn)行性的肺間質(zhì)疾病,其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(主要是膠原纖維)在肺間質(zhì)過度積聚?，F(xiàn)已公認(rèn),基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)和其組織抑制因子(tissue inhibitor of metaloproteinases)的失衡,是肺纖維化的發(fā)病機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),各種原因引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷均可暴露基底膜,而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix

2、metalloproteinase-9,MMP-9)即Ⅳ型膠原酶,可以降解基底膜,使基底膜和肺泡隔中形成許多空隙,有利于激活的成纖維細(xì)胞向肺泡隔空隙中遷移和增殖,導(dǎo)致肺泡隔增厚?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)又稱膠原酶3,主要降解Ⅰ～Ⅲ型膠原,并具有明膠酶樣作用,是鼠類主要的間質(zhì)膠原酶。TIMPs可以抑制MMPs的活性,因此,MMP-9、MMP-13與TIMPs的失衡參與了肺

3、泡炎形成,肺基底膜破壞及肺纖維化形成過程。
　　 博萊霉素(bleomycin,BLM)是一種常見的抗腫瘤化療藥,其毒副作用主要是引起亞急性肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化。氣管內(nèi)滴注BLM是公認(rèn)的復(fù)制肺纖維化模型方法。我課題組以往研究結(jié)果顯示,腹腔注射誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抑制劑氨基胍(aminoguanidine,AG)20 mg/kg.d可以有效的防治BLM導(dǎo)致

4、的PF,但是其作用機(jī)制尚待研究。AG能否通過改善PF形成過程中MMP-9、MMP-13及TIMPs的失衡,而起到防治肺纖維化的作用,迄今尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過分別觀察AG對(duì)BLM誘導(dǎo)大鼠PF早期(1-14d)和晚期(14-28d)肺組織勻漿中MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的影響,旨在闡明AG防治肺纖維化的可能機(jī)制,并為此藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。
　　 方法:明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9、MMP-

5、13含量和活性;反義酶譜法檢測(cè)TIMPs活性;用天狼猩紅組化染色法和肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量測(cè)定法,判斷肺纖維化的程度;用HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化,并輔助天狼猩紅染色的肺間質(zhì)膠原的定位。
　　 將58只健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)(♂)(體重170-180g)大鼠隨機(jī)分為三組:1.動(dòng)態(tài)觀察組(n=12):分7d(n=4),14d(n=4)和28d(n=4)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。大鼠分別于氣

6、管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)或NS(0.5 ml/kg)后第8 d、15和29 d被處死取肺,用于檢測(cè)MMP-9、MMP-13及TIMP-1的活性。2.早期給藥組(即1-14d給藥組)(n=16):其中14dNS+14dNS大鼠(n=3)于氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后,每天腹腔注射NS(1 ml/kg),連續(xù)14d;14dM+14dNS大鼠(n=8)于氣管內(nèi)滴注BLM(5 mg/kg)后,每天腹腔注射NS(1

7、ml/kg),連續(xù)14d;14dM+14dAG大鼠(n=5)氣管內(nèi)滴注BLM(5 mg/kg)后,每天腹腔注射AG(20 mg/kg.d),連續(xù)14d。此組大鼠于氣管給藥后第15 d取肺,肺組織分別用于MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性的檢測(cè)以及形態(tài)學(xué)觀察(天狼猩紅和HE染色)。3.晚期給藥組(即14-28d給藥)(n=30):其中28dNS+后14dNS大鼠(n=9)在氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后第14

8、d至28d期間,每天腹腔注射NS(1 ml/kg);28dM+后14dNS大鼠(11=10)在氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期間,每天腹腔注射NS(1 ml/kg)28dM+后14dAG大鼠(n=11)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期間,每天腹腔注射AG(20mg/kg.d)。大鼠均在氣管滴注后第29d取肺,分別用于MMP-9、MMP-13含量和活性的檢測(cè)及TIMPs活性的檢測(cè)、

9、形態(tài)學(xué)觀察(天狼猩紅染色和HE染色)以及羥脯氨酸含量測(cè)定。
　　 JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算肺組織膠原天狼猩紅染色的陽性面積百分比;Alpha FC凝膠成像分析軟件分析MMP-9、MMP-13含量和活性及TIMPs活性。采用SPSS-13.0統(tǒng)計(jì)軟件,MMP-9、MMP-13及TIMPs數(shù)據(jù)通過秩轉(zhuǎn)換結(jié)合完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析來進(jìn)行組間差異的兩兩比較,以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。HYP和膠原含量的所有數(shù)據(jù)

10、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±SD)表示,采用SPSS-13.0統(tǒng)計(jì)軟件,多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA),多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(1east significant difference,LSD),以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在肺纖維化的早期階段(1-14d),AG完全阻止模型大鼠肺MMP-9含量增多,并阻止MMP-9活性的增強(qiáng)。同時(shí)阻止了MM

11、P-13含量的增多,而對(duì)MMP-13及TIMPs活性變化無明顯影響;并且,AG抑制肺泡間隔的增厚。由此推測(cè),阻止模型大鼠肺MMP-9含量的升高和活性的增強(qiáng)是AG抑制肺泡間隔增厚,延緩肺纖維化進(jìn)程的機(jī)制。
　　 2.在肺纖維化晚期階段(14-28d),AG完全阻止了模型大鼠肺MMP-9含量增多和活性的增強(qiáng),阻止了MMP-13含量降低和活性減弱,而對(duì)TIMPs的活性無明顯影響。同時(shí),AG阻止了模型大鼠肺間質(zhì)膠原的堆積。由此推斷,糾正