反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠TIMP-1和MMP-2表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：肺纖維化是由于各種急性和慢性肺損傷后引起細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)成分組成及量的改變、ECM在肺中病理性沉積，造成肺功能異常的重要因素。肺纖維化的過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。雖然引起肺纖維化的病因或原發(fā)病因有很大差異，但是肺纖維化過(guò)程中ECM代謝異常是類似的。如果肺內(nèi)ECM的合成增加，或降解減少，或二者都有，都能引起ECM積聚，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化形成。然而，現(xiàn)仍無(wú)有效的治療方法。 近年來(lái)

2、的研究表明ECM降解減弱是引起ECM積聚的重要因素，認(rèn)為肺纖維化過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(Tissueinhibitorsofmetalloproternase-1，TIMP-1)表達(dá)增高，抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)的活性，使ECM降解減少，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，因此抑制TIMP-1的表達(dá)是阻止肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究以博來(lái)霉素(Bleomycin，BLM

3、)誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠為模型，觀察肺纖維化過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)及TIMP-1基因及蛋白表達(dá)的變化。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察的上述變化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用反義核酸技術(shù)將正、反義TIMP-1cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染到不同階段肺纖維化大鼠模型肺內(nèi)，觀察內(nèi)源性TIMP-1的表達(dá)變化，了解外源基因治療性質(zhì)粒的療效，探討基因治療肺纖維化的可行性及有效性，為今后臨床肺纖維化的基因治療提供理論依據(jù)。

4、 方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡SD大鼠，雌性，體重180-220g2.動(dòng)物模型制備：大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，頸前暴露氣管，一次性氣管內(nèi)注入0.4﹪BLM生理鹽水注射液(5mg/kg)，均由腹主動(dòng)脈取血處死3.分組：共分兩部分，每小組各6只大鼠 (1)觀察給予BLM后不同階段肺纖維化大鼠TIMP-1和MMP-2表達(dá)的變化：分兩組：①肺纖維化組(用B代表)分為7個(gè)亞組：B1、B3、B7、B14、B28、B60、B90組，分別代表給予

5、BLM后第1、3、7、14、28、60、90天；②正常對(duì)照組(用N代表)：取同期大鼠處死； (2)觀察基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺纖維化大鼠TIMP-1和MMP-2表達(dá)的影響：分4大組：①正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組：按照基因轉(zhuǎn)染時(shí)間的不同分為7個(gè)亞組：B正1+28、B正3+28、B正7+28、B正14+28、B正28+28、B正60+28、B正90+28。即于給予BLM后第1、3、7、14、28、60、90天按上述方法一次性氣管內(nèi)注射含正義人TIM

6、P-1cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞上清0.5ml，轉(zhuǎn)染28天后處死；②反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組：按上述方式分為7個(gè)亞組：B反1+28、B反3+28、B反7+28、B反14+28、B反28+28、B反60+28、B反90+28；③空載體轉(zhuǎn)染組：分為7個(gè)亞組：B空1+28、B空3+28、B空7+28、B空14+28、B空28+28、B空60+28、B空90+28；④肺纖維化對(duì)照組：僅給予BLM干預(yù)，分為7各亞組：B1+28、B3+28、B7+

7、28、B14+28、B28+28、B60+28、B90+28組 4.研究方法：應(yīng)用蘇木素—伊紅(HE)染色、Masson三色染色法觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)SP法分析肺組織中TIMP-1和MMP-2的基因和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.光鏡病理形態(tài)學(xué)觀察(HE和Masson三色染色)：肺纖維化模型復(fù)制成功；且B反1+28與B1+28組、B空1+28組及B反3+28與B3+2

8、8組、B空3+28組比較纖維化程度明顯減輕。B正1+28、B正3+28組纖維化程度增加。給予BLM后第7、14、28、60、90進(jìn)行正、反義TIMP-1轉(zhuǎn)染與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組、空載體轉(zhuǎn)染組比較無(wú)明顯不同；不同階段的空載體轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組比較無(wú)明顯變化。 2.RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法分析各組不同階段肺組織中TIMP-1、MMP-2的基因和蛋白的表達(dá)變化 (1)給予BLM后不同階段肺纖維化大鼠TIM

9、P-1和MMP-2表達(dá)的變化：TIMP-1mRNA和MMP-2mRNA及蛋白在正常肺組織中有表達(dá)，但較弱。肺纖維化組TIMP-1和MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)在給予BLM后第1天明顯增加，第7天MMP-2表達(dá)達(dá)到高峰，直到28天才略下降，60天基本回到基線水平。而TIMP-1表達(dá)在給予BLM后第90天未見明顯下降，仍持續(xù)高表達(dá)。 (2)基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺纖維化大鼠TIMP-1和MMP-2表達(dá)的影響：B1+28與B1+28組、B1+28

10、組及B反3+28與B3+28組、B空3+28組比較TIMP-1表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)。B正1+28、B正3+28組TIMP-1表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，且B反1+28組、B反3+28組TIMP-1的表達(dá)仍高于正常組(P＜0.01)，均有顯著性差異。給予BLM后第7、14、28、60、90天進(jìn)行正、反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染TIMP-1的表達(dá)與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組、空載體轉(zhuǎn)染組比較無(wú)明顯不同(P＞0.05)。不同階段進(jìn)行空載體轉(zhuǎn)

11、染與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組比較TIMP-1表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。而不同階段進(jìn)行正、反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染、空載體轉(zhuǎn)染與同一時(shí)間點(diǎn)的肺纖維化組比較，各組間MMP-2表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：(1)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化早期TIMP-1表達(dá)即升高并持續(xù)高表達(dá)，MMP-2表達(dá)早期增加，后期下降。 (2)給予BLM后第1、3天進(jìn)行反義TIMP-1基因轉(zhuǎn)染可以在一定程度上抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)展。