反義TIMP-1表達(dá)質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化影響的體外研究.pdf

1、背景:肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ),是臨床向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié).目前研究認(rèn)為肝纖維化屬于可逆性病變.HSC在肝纖維化過(guò)程中居核心地位,HSC體外活化過(guò)程可以模擬肝纖維化的體內(nèi)發(fā)展過(guò)程.該研究旨在構(gòu)建反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,并應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將其攜帶導(dǎo)入大鼠HSC中,檢測(cè)外源質(zhì)粒在HSC中的表達(dá),同時(shí)體外觀察外源質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響,這可能有助于為將來(lái)臨床慢性肝病肝纖維化的治療

2、提供新的有效途徑.方法:根據(jù)大鼠TIMP-1全基因cDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增用套式引物,運(yùn)用巢式RT-PCR及基因重組技術(shù)擴(kuò)增TIMP-1片段,分離、回收和純化TIMP-1 PCR產(chǎn)物,經(jīng)與T載體連接后轉(zhuǎn)染JM-109大腸桿菌,通過(guò)IPTG/X-gal藍(lán)白篩選后構(gòu)建T載體克隆-PT/TIMP-1,再?gòu)闹星邢履康钠?反向插入到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3中,即構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/反義TIMP-1,再轉(zhuǎn)染JM-109菌株.

3、通過(guò)酶切鑒定及DNA測(cè)序分析證實(shí)TIMP-1反義真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功.大量提取大量提取質(zhì)粒.應(yīng)用含I型膠原酶和鏈絲菌蛋白酶E的肝臟灌注液原位灌注肝臟,通過(guò)梯度離心方法,離心后得到HSC,應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法辨別細(xì)胞活力,計(jì)數(shù)后培養(yǎng).細(xì)胞爬片后應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞Desmin和α-SMA表達(dá),證實(shí)所分離的細(xì)胞系肝星形細(xì)胞.通過(guò)脂質(zhì)體將該反義表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠HSC內(nèi),以G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆;同時(shí)以脂質(zhì)體攜帶熒光蛋白表面質(zhì)粒pEGF

4、P轉(zhuǎn)染HSC,并用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞,評(píng)估轉(zhuǎn)染效率.運(yùn)用Northern blot方法檢測(cè)外源導(dǎo)入質(zhì)粒在HSC中的表達(dá)情況;運(yùn)用Western blot法檢測(cè)HSC中TIMP-1蛋白質(zhì)水平的表達(dá)、HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量;通過(guò)FITC-標(biāo)記的Ⅰ型膠原底物測(cè)定HSC培養(yǎng)上清液中間質(zhì)膠原酶活性的改變情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件作方差分析(多樣本均數(shù)的兩兩比較).結(jié)論:反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)?？擅黠@抑制HSC中TIMP-1的表達(dá),