阿托伐他汀對實驗性肺纖維化的保護及其MMP-9、TIMP-1表達影響.pdf

1、本文研究目的：觀察阿托伐他汀對博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導的大鼠實驗性肺纖維化的形成過程是否具有保護作用，觀察阿托伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達的影響，初步探討阿托伐他汀抗肺纖維化的機制?；诔衫w維細胞在肺纖維化形成中的作用以及是分泌基質金屬蛋白酶的關鍵細胞之一，觀察阿托伐他汀對其干預作用及其分泌的MMP-9、TIMP-1的影響，為探討阿托伐他汀抗肺纖維化作用的機制提供實驗依據(jù)。 研究材料與

2、方法： 博萊霉素氣管內注入制備大鼠肺纖維化模型，分為模型2、4、6周組(M2、M4、M6)，阿托伐他汀亦按干預時間分為2、4、6周組(A2、A4、A6)。通過大體標本、肺泡灌洗液(BALF)、病理切片HE染色、Masson染色、酸解法測定肺組織羥脯胺酸的含量等方法，觀察肺泡炎、肺纖維化的情況。Gelatin Zymography明膠酶譜分析BALF的MMP-9活性；ELISA檢測肺泡灌洗液、血清中MMP-9、TIMP-1的濃度；

3、RT-PCR檢測肺組織MMP-9、TIMP-1mRNA的表達；Western-blot檢測肺組織MMP-9、TIMP-1的蛋白表達。博萊霉素制備大鼠肺纖維化模型，1周后處死，提取肺成纖維細胞，阿托伐他汀進行干預。MTT法測定細胞存活率；底物酶譜法分析Ⅳ型膠原酶的分泌及活性； [<'3>H]-脯氨酸滲入評價脯氨酸含量的變化；RT-PCR檢測細胞分泌的MMP-9、TIMP-1mRNA的表達；Western-blot檢測細胞培養(yǎng)液中MMP-9

4、、TIMP-1、膠原Ⅳ、纖維連接蛋白的蛋白表達。 研究結果： 阿托伐他汀對博萊霉素致大鼠肺纖維化有一定的保護作用，各治療組的肺間質纖維化程度較相應的BLM組均有減少，其中A4組(0.50±0.32)較M4組(0.81±0.25)、A6組(0.19±0.24)較M6組(0.76±0.18)比較具有顯著性差異(P<0.01)，A2組與M2組比較雖無統(tǒng)計學意義，但仍有減少的趨勢。HE染色、Masson染色顯示：阿托伐他汀各組大

5、鼠肺泡炎及肺纖維化程度較同時期模型組明顯減輕，尤其是6周治療組，肺泡間隔增厚程度明顯減少，雖仍可見成纖維細胞增生，膠原增多，但纖維化面積及病灶明顯縮小。阿托伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織羥脯胺酸的影響結果顯示：從2周開始，BLM組大鼠肺組織HYP就明顯高于對照組，而BLM組之間HYlP的含量有下降的趨勢；阿托伐他汀組則從2周開始低于相應的BLM組，HYP呈降低趨勢，表明阿托伐他汀對HYP的合成有一定的的抑制作用。阿托伐他汀對肺纖維化大鼠血氣

6、的影響：BLM各組與對照組比較，PaO<,2>均下降，尤其是2周BLM組，此時模型處于肺泡炎階段。各治療組與同期的BLM組相比，PaO<,2>均有不同程度的升高，盡管仍低于對照組，但隨著治療時間的延長，PaO<,2>越來越接近對照組，說明阿托伐他汀可改善肺纖維化大鼠的氧合功能。BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)顯示M2、A2組BALF細胞總數(shù)及中性粒細胞有增高趨勢，但統(tǒng)計學無顯著性差異。 Gelatin Zymography明膠酶譜分析BAL

7、F中MMP-9活性顯示：各組BALF均可使明膠底物分解。2周、4周模型組的MMP-9活性均高于對照組(P<0.01)，2周組活性最高。隨著肺纖維化的進程，MMP-9的活性逐漸下降，6周組與對照組相比較無明顯統(tǒng)計學差異。阿托伐他汀處理組的MMP-9活性受到一定程度阻斷，尤其是阿托伐他汀處理的2周組MMP-9活性下降最明顯。而6周組與模型組比較雖有下降的趨勢，但并無統(tǒng)計學意義。EIISA分析。BALF中MMP-9、TIMP-1的濃度顯示：博

8、萊霉素致大鼠肺纖維化的進程中，BALF中的MMP-9的濃度肺泡炎階段(2周)最高(P<0.01)，后逐漸下降，但均高于對照組。而阿托伐他汀各組分泌的MMP-9均有降低，但仍高于對照組。說明阿托伐他汀對肺組織分泌的MMP-9有抑制作用。但血清中的MMP-9模型組及阿托伐他汀組均無明顯統(tǒng)計學差異，故阿托伐他汀對系統(tǒng)分泌的MMP-9無影響。博萊霉素致大鼠肺纖維化的進程中，2～6周內BALF中的TMP-1的濃度逐漸升高(P<0.01)。而阿托伐

9、他汀干預的各組分泌的TIMP-1均有降低。說明阿托伐他汀對肺組織TIMP-1的分泌有抑制作用。但血清中的TIMP-1在模型組及阿托伐他汀組較對照組均無明顯統(tǒng)計學差異，故阿托伐他汀對系統(tǒng)分泌的TlMP-1影響不大。RT-PCR顯示：正常對照組、博萊霉素2周、4周、6周組肺組織勻漿中均有MMP-9、TIMP-1mRNA的表達。與對照組比較，模型組在2周MMP-9、TIMP-1mRNA基因轉錄水平均顯著增高，尤以MMP-9增加明顯，在4周、6

10、周時，MMP-9已有所降低，但TIMP-1 mRNA表達仍持續(xù)性增高。與模型組比較，治療組第2周MMP-9、TIMP-1 mRNA基因轉錄水平降低，尤其是MMP-9的表達降低更為明顯，在4周、6周時這種降低作用仍持續(xù)存在。Western blot結果顯示：正常對照組、博萊霉素2周、4周、6周組肺組織勻漿中均有MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。與對照組比較，模型組在2周MMP-9、TIMP-1蛋白表達均顯著增高，在4周時，MMP-9已有

11、所降低，但TIMP-1蛋白表達仍持續(xù)性增高，直至第6周才有下降的趨勢。與模型組比較，各治療組MMP-9、TlMP-1蛋白表達水平均降低。細胞培養(yǎng)MTT顯示：阿托伐具有顯著抑制成纖維細胞增殖的作用，與對照組比較，1μM的阿托伐他汀組的細胞數(shù)降至78.5±8％(P<0.01)，5μM組的細胞數(shù)降至49.8±12.6％(P<0.001)，10μM組的細胞數(shù)降至36.1±10.7％(P<0.001)，0.01μM和0.1μM的阿托伐他汀對細胞的

12、抑制與對照組相比較無顯著的差異，分別為98.3±10.8％(P=0.35) ，92.2±8.4％(P=0.13)。Gelatin Zymography明膠酶譜分析結果表明：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖維細胞分泌的MMP-9分別減少至(79.11±14.39)％(P=0.1)和(56.74+12.98)％(P<0.01)，而MMP-2分別為(103.90±5.46)％，(79.07±16.75)％；后者雖有下降趨勢但并

13、無統(tǒng)計學意義。Western blot分析細胞培養(yǎng)液中MMP-9、TIMP-1酶活性示：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖細胞分泌的MMP-9分別減少至(84.67±11.74)％(P=0.31)和(29.15±6.03)％(P<0.05)。TIMP-1分別減少至(48.89±1.92)％(P<0.01)和(30.37±2.80)％(P<0.001)。 Westemblot顯示暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成

14、纖細胞分泌的膠原Ⅳ分別減少至65.9±9.32(P<0.05)、42.6±8.5％(P<0.01)。與之類似，暴露于5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖細胞分泌的纖維連接蛋白減少至對照組的20.6±4.2％(P<0.01)。[<'3>H]-脯氨酸滲入結果顯示：1μM的阿托伐他汀減少脯氨酸的結合至77.1±15.0％(P<0.05)，5μM的阿托伐他汀減少至54.7±6.6％(P<0.05)。RT-PCR分析阿托伐他汀對成纖維細胞的MMP-

15、9、TIMP-1的mRNA表達的影響結果顯示，不同濃度的阿托伐他汀處理肺纖維化成纖維細胞72h后MMP-9、TIMP-1 mRNA表達均減少(P<0.05)。 研究結論： 1．阿托伐他汀可減輕博萊霉素所致大鼠的肺纖維化。 2．阿托伐他汀抑制博萊霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的MMP-9、TIMP-1的合成及分泌。 3．阿托伐他汀具有抑制博萊霉素誘導大鼠肺成纖維細胞增殖的作用，并能抑制成纖維細胞分泌的MMP-