自噬在晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡與促M(fèi)MP-3及MMP-13表達(dá)中的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的主要致病因素是高齡，高齡導(dǎo)致的 OA常伴隨關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的蓄積增多。OA的典型病理特征是軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在軟骨分解代謝中發(fā)揮重要作用，能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)( extracellul

2、ar matrix，ECM)蛋白。自噬（autophagy）是一種生理或病理?xiàng)l下應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，主要通過降解細(xì)胞中的大分子和受損的細(xì)胞器來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。我們推測自噬在AGEs引起OA病理變化中具有重要作用。因此，本研究擬探討AGEs對軟骨細(xì)胞凋亡及MMP-3和MMP-13的表達(dá)影響，并進(jìn)一步闡明自噬在AGEs引起軟骨細(xì)胞的病理變化過程的作用。
　　方法：
　?。?）大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)，取第2代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、

3、阿爾新藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
　　（2）不同濃度AGEs處理軟骨細(xì)胞24h后，CCK-8法和Western blot分別檢測軟骨細(xì)胞生存率及MMP-3和MMP-13的蛋白表達(dá)水平；
　?。?）AGEs處理軟骨細(xì)胞不同時(shí)間后，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分別檢測軟骨細(xì)胞凋亡率及MMP-3和MMP-13的蛋白表達(dá)水平；
　　（4） AGEs處理軟骨細(xì)胞不同時(shí)間后， We

4、stern blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3B表達(dá)水平，并通過mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞并與AGEs培養(yǎng)后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬流變化；
　　（5）分別以自噬阻滯劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）及自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin, RA）預(yù)處理軟骨細(xì)胞1h后，再加入AGEs共培養(yǎng)， Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)和 Western blot

5、分別檢測軟骨細(xì)胞凋亡率及MMP-3和MMP-13的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）軟骨細(xì)胞呈三角形或多角形貼壁生長。甲苯胺藍(lán)染色見軟骨細(xì)胞包漿藍(lán)色，細(xì)胞核紫藍(lán)色。阿爾新藍(lán)染色后細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色見細(xì)胞質(zhì)黃色，細(xì)胞核周圍散在棕黃色顆粒；
　?。?）不同濃度AGEs（0,10,25,50,100,200μg/mL）處理軟骨細(xì)胞24h，50,100,200μg/mL濃度AGEs可顯著降低軟骨細(xì)胞存

6、活率(P＜0.01)，不同濃度AGEs（25,50,100μg/mL）處理軟骨細(xì)胞24h后， MMP-3及MMP-13蛋白表達(dá)量較對照組均顯著升高，并隨濃度增加而增加(P＜0.01)；
　　（3）100μg/mL AGEs處理軟骨細(xì)胞不同時(shí)間（0,3,6,12,24h）后，Beclin-1及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)量于6h(p＜0.01)表達(dá)量最高，并隨時(shí)間推移而下降。100μg/mL AGEs處理mCherry-GFP-LC3B

7、腺病毒轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞紅色熒光于6h顯著增加(P＜0.01)；
　?。?）100μg/mL AGEs處理軟骨細(xì)胞不同時(shí)間（0,3,6,12,24h）后，處理6h后軟骨細(xì)胞凋亡率較正常組顯著增加(p＜0.01)，處理3h后MMP-3及MMP-13表達(dá)量較正常組顯著增加(P＜0.05)；
　?。?）分別3-MA(5mM)和RA(5μM)預(yù)處理軟骨細(xì)胞1h后與100μg/mL AGEs共培養(yǎng)6h,3-MA+AGEs組較A