利拉魯肽對晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過檢測利拉魯肽（Liraglutide，Lira）對晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycosylation end products，AGEs）誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）增殖、凋亡、受體表達(dá)、成骨分化及炎癥因子表達(dá)的作用，探討hPDLCs在AGEs積累時，Lira對hPDLCs的保護(hù)及修復(fù)作用。
　　方法：
　　采用酶消化法聯(lián)合組

2、織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)原代hPDLCs，取3-6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用細(xì)胞化學(xué)染色及成骨誘導(dǎo)21天茜素紅染色法進(jìn)行hPDLCs鑒定。采用MTT法篩選Lira對AGEs誘導(dǎo)的hPDLCs的最佳作用濃度及作用時間。采用MTT法檢測Lira對AGEs誘導(dǎo)的hPDLCs增殖活性的影響。采用Hoechst33258熒光染色法及Annexin-V-FITC/PI雙染檢測凋亡水平。采用Real-time PCR及Western Blot檢測晚期糖基化終

3、末產(chǎn)物受體RAGE及胰高血糖素樣肽受體GLP-1R的表達(dá)水平、成骨因子Runx2和ALP的表達(dá)水平、炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。采用茜素紅染色法檢測礦化結(jié)節(jié)形成水平。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞化學(xué)染色：HE染色細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣長梭形外觀；抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證明細(xì)胞來源為中胚層；茜素紅染色見礦化結(jié)節(jié)形成證明細(xì)胞具有成骨分化能力。綜上可鑒定細(xì)胞為人牙周膜細(xì)胞；
　　2.MTT結(jié)果：AGEs

4、對hPDLCs細(xì)胞增殖抑制作用的最佳作用濃度是100μg/mL，最佳作用時間是48h；Lira對AGEs誘導(dǎo)的hPDLCs的最佳作用濃度是100nmol/mL，最佳作用時間是24h；與對照組相比，AGEs組的增殖抑制率顯著增高（P﹤0.01），Lira組的增殖抑制率顯著降低（P﹤0.01），AGEs+Lira組的增殖抑制率顯著高于Lira組（P﹤0.01），但低于對照組。
　　3.Western Blot及Real-time PC

5、R結(jié)果：（1）受體表達(dá)：hPDLCs上RAGE蛋白及mRNA及GLP-1R蛋白及mRNA的表達(dá)。相比對照組，AGEs組顯著促進(jìn)RAGE的表達(dá)（P﹤0.01），抑制GLP-1R的表達(dá)（P﹤0.05）；Lira組抑制RAGE的表達(dá)（P﹤0.05），促進(jìn)GLP-1R的表達(dá)（P﹤0.05），與AGEs組相比，AGEs+Lira組抑制RAGE的表達(dá)（P﹤0.05），促進(jìn)了GLP-1R的表達(dá)（P﹤0.05）；（2）成骨因子：相比對照組，AGEs組抑

6、制Runx2和ALP蛋白及mRNA的表達(dá)（P﹤0.01， P﹤0.05），Lira組促進(jìn)Runx2和ALP的表達(dá)（P﹤0.05，P﹤0.01），與AGEs組相比，AGEs+Lira組促進(jìn)Runx2和ALP的表達(dá)（P﹤0.05，P﹤0.01）；（3）炎癥因子：相比對照組，AGEs組促進(jìn)IL-6及TNF-α蛋白及mRNA的表達(dá)（P﹤0.01），Lira組抑制IL-6及TNF-α的表達(dá)（P﹤0.05，P﹤0.01），與AGEs組相比

7、，AGEs+Lira組抑制IL-6及TNF-α的表達(dá)（P﹤0.01）；
　　5.Hoechst33258染色Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果：對照組和Lira組的細(xì)胞核均未發(fā)生改變；AGEs組細(xì)胞核發(fā)生皺縮，染色質(zhì)濃縮或斷裂；AGEs+Lira組細(xì)胞發(fā)生核皺縮，染色質(zhì)濃縮或斷裂的細(xì)胞減少。相比對照組，AGEs組的凋亡率顯著增高（P﹤0.01）；Lira組降低（P﹤0.01）；相比AGEs組，AGEs+Lira組的凋

8、亡率顯著降低（P﹤0.01），但高于對照組；
　　7.茜素紅染色結(jié)果：AGEs組的紫紅色礦化結(jié)節(jié)明顯少于對照組，AGEs+Lira組的紫紅色礦化結(jié)節(jié)明顯多于AGEs組。經(jīng)Image J軟件對染色進(jìn)行分析，Lira組與對照組，對照組與AGEs組，AGEs+Lira組與AGEs組之間均表現(xiàn)出明顯差異（P﹤0.05，P﹤0.01，P﹤0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Lira對AGEs誘導(dǎo)的hPDLCs的最佳作用濃度是100