晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號傳導(dǎo)通路在慢性氟中毒神經(jīng)損傷中的作用.pdf

1、慢性氟中毒不僅損害牙齒和骨骼,同時還能引起神經(jīng)系統(tǒng)等全身各組織器官的廣泛損傷。但是,關(guān)于慢性氟中毒引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明清楚。近年來,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變可能是慢性氟中毒致神經(jīng)損傷的機(jī)制之一。為了深入進(jìn)行該方面的研究,本實驗復(fù)制了飲水型慢性氟中毒大鼠模型和體外染氟神經(jīng)細(xì)胞模型,研究晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advancedglycosylationendproducts,AGEs)及其受體(Receptorforadva

2、ncedglycationendproducts,RAGE)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變,探討其在慢性氟中毒神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制。
　　AGEs是一類由蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)與糖在非酶催化下形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)。AGEs可通過糖基化作用直接破壞機(jī)體內(nèi)許多蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu),還可通過與特異受體RAGE結(jié)合,引起下游多條信號通路的改變,產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。目前,在AGE/RAGE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)的下游因子中,以細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear

3、factorκB,NF-κB)研究較多。NF-κB是多種“損傷反應(yīng)基因”的多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其激活可促使下游損傷因子的表達(dá),導(dǎo)致組織損傷。
　　本實驗用SD(SpragueDawley)大鼠120只,隨機(jī)分為3組(每組40只,雌雄各半,1個月鼠齡),采用飲水中加氟的方法來復(fù)制慢性氟中毒大鼠模型。正常對照組(對照組):自由飲用自來水(自來水含NaF量低于0.5mg/L);低劑量染氟組(低氟組):在自由飲水中加入10mg/LNaF;高

4、劑量染氟組(高氟組):在自由飲水中加入50mg/LNaF;實驗期為三個月和六個月。另外,用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)進(jìn)行加氟培養(yǎng),來復(fù)制體外染氟神經(jīng)細(xì)胞模型;氟處理濃度為0.4mM/L和4.0mM/L。用形態(tài)學(xué)檢查方法觀察大鼠腦組織神經(jīng)病理學(xué)改變;用酶聯(lián)免疫(ELISA)方法檢測大鼠腦組織和培養(yǎng)細(xì)胞中AGEs含量;用免疫組織化學(xué)方法檢測AGEs和RAGE在腦組織中的定位表達(dá);用蛋白印跡和Real-timePCR方法檢測大鼠腦組

5、織和細(xì)胞模型中AGE/RAGE信號傳導(dǎo)通路蛋白和相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平;用熒光染色法測定體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平;用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率;用RAGE阻斷劑,維生素C(VitaminC,VitC)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化劑處理體外培養(yǎng)細(xì)胞,檢測通路蛋白因子的表達(dá)變化、細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平和細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果顯示,飲水加氟組大鼠毛發(fā)無光澤,活動

6、減少,精神萎靡,部分呈現(xiàn)煩躁不安等;染氟組大鼠出現(xiàn)不同程度的氟斑牙、尿氟含量明顯高于對照組,其改變程度與染氟劑量和染氟時間呈正相關(guān);染氟大鼠大腦皮質(zhì)HE染色顯示,神經(jīng)細(xì)胞排列輕度紊亂,其余未見明顯改變。實驗結(jié)果表明本實驗成功地復(fù)制出慢性氟中毒大鼠模型。
　　酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,染氟三個月的兩組大鼠腦組織AGEs含量未見明顯改變,而染氟六個月時大鼠腦組織AGEs含量明顯增高。免疫組化結(jié)果顯示AGEs定位于細(xì)胞間質(zhì)和胞

7、漿,而RAGE定位于細(xì)胞膜上;與對照組比較,染氟三個月的兩組大鼠腦組織AGEs和RAGE含量未見明顯改變,而染氟六個月時大鼠腦組織AGEs和RAGE含量明顯增高。RAGE的蛋白印跡和mRNA表達(dá)結(jié)果顯示,與對照組比較,染氟六個月時大鼠腦組織RAGE蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平均增高,與免疫組化結(jié)果相一致。細(xì)胞染氟24小時后,RAGE表達(dá)開始升高,表達(dá)增加與染氟時間呈正相關(guān)。
　　蛋白印跡檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗三個月時高氟組大鼠腦組

8、織中NF-κB增高,而低、高氟組大鼠腦組織中NF-κB的抑制蛋白(inhibitorofNF-κB,IκB)均降低,激酶Ras和腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactor,TNF-α)表達(dá)無變化;實驗六個月時低、高氟組大鼠腦組織中激酶Ras、NF-κB和TNF-α表達(dá)均明顯增高,而低、高氟組中IκB均明顯降低。Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,NF-κB和TNF-α的mRNA表達(dá)較對照組升高,與蛋白印跡檢測結(jié)果一

9、致。細(xì)胞染氟24小時后,NF-κB表達(dá)開始升高,表達(dá)增加與染氟時間呈正相關(guān)。
　　實驗三個月時,與對照組相比,低、高氟組大鼠腦組織中NADPH氧化酶亞基NOX2(nonphagocyticcelloxidase2,NOX2)蛋白水平表達(dá)無變化;實驗六個月時低、高氟組大鼠腦組織中NOX2表達(dá)均明顯增高。Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,NOX2的mRNA表達(dá)較對照組升高,與蛋白印跡檢測結(jié)果一致。細(xì)胞染氟12小時后,NOX

10、2表達(dá)開始升高,表達(dá)增加與染氟時間呈正相關(guān);與對照組比較,染氟培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中ROS含量均升高。
　　蛋白檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,低、高氟組大鼠腦組織中B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcelllymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bcl-2accociatedxprotein,Bax)和天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinylaspartatespecificproteinase,Caspas-3)表達(dá)無變化;實驗

11、六個月時低、高氟組大鼠腦組織中Caspas-3表達(dá)明顯增高,Bcl-2表達(dá)降低,Bax表達(dá)無明顯變化;Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,Bcl-2的mRNA表達(dá)較對照組降低,Bax的mRNA表達(dá)較對照組升高,Caspas-3的mRNA表達(dá)無變化。染氟培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均升高。
　　用RAGE阻斷劑和抗氧化劑加氟處理細(xì)胞后,可不同程度抑制高氟引起的NF-κB、NOX2的蛋白表達(dá)升高,降低染氟細(xì)胞的凋亡率和ROS水平,差異

12、有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　綜上所述,慢性氟中毒可激活A(yù)GE/RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,引起該通路下游激酶Ras、NF-κB、NOX2等因子的激活,導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高,可能促進(jìn)炎癥因子釋放,造成神經(jīng)細(xì)胞損傷;AGE/RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變還可能激發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程。采用RAGE阻斷劑和抗氧化劑處理后,可明顯抑制氟引起的下游NF-κB和NOX2激活,同時下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和氧化應(yīng)激水平。研究結(jié)果表明,AGE/RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變在慢