晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其配體HMGB1在大鼠重癥急性胰腺炎發(fā)病中的作用研究.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床的危重急癥，大多數(shù)患者是輕癥胰腺炎，且為自限性，通常在發(fā)病數(shù)日后可好轉(zhuǎn)；但仍有約20％—30％的患者表現(xiàn)為重癥急性胰腺炎。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)以全身炎癥反應(yīng)綜合癥、多器官功能衰竭及胰腺局部并發(fā)癥為特征，盡管臨床治療方法不斷改善，但目前病死率仍高達15—30％。早期階段的多器官功能衰竭及后期感染等并發(fā)癥是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎

2、高死亡率的主要原因。多器官功能衰竭是全身性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，值得注意的是過度激活的巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞釋放的炎癥因子可能導(dǎo)致遠處器官的損傷。在重癥急性胰腺炎的發(fā)病過程中，胰腺局部、以及全身性炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。深入認識和研究重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)機制，對于其治療方法的探索一直是研究的熱點。
　　 SAP的一個重要問題是尚沒有一個特異的血清學或者其他指標來診斷和預(yù)測預(yù)后，進而指導(dǎo)治療。目前臨床上已有通過檢測血清淀粉酶

3、和C—反應(yīng)蛋白等判斷SAP預(yù)后，但是應(yīng)用價值非常有限。
　　 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)，屬于細胞表面分子免疫球蛋白超家族多配體受體成員，廣泛分布在單核—巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、腎小球系膜細胞、腫瘤細胞、星形膠質(zhì)細胞、T淋巴細胞等細胞表面：晚期糖基化終末產(chǎn)物受體是介導(dǎo)HMGB1細胞因子活性的重要受體。除HMGB1，其

4、配體還包括糖基化終末產(chǎn)物、β淀粉樣肽、S100蛋白等。RAGE與其配體相互作用常導(dǎo)致快速持續(xù)的細胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，多種細胞信號ERK1/2(p44/p42)、p38和SAPK/JNK MAP激酶，rho—GTP酶類，磷酸肌醇—3—激酶和JAK/STAT信號途徑在不同類型細胞中被激活，并通過核因子—kappaB(NuclearFactor—kappaB，NF—kB)持久活化維持和擴大炎癥反應(yīng)。有報道指出，RAGE敲除小鼠能耐受盲腸結(jié)扎

5、穿孔引起的感染性休克，表明RAGE在系統(tǒng)性急性炎癥過程中發(fā)揮重要作用。
　　 RAGE屬于單跨膜片段受體，分為胞外段、疏水的跨膜區(qū)和胞內(nèi)段3部分：其胞外部分包含了一個“V”型區(qū)和兩個“C”型區(qū)，與HMGB1結(jié)合的主要部位位于N端的“V”型區(qū)。最近，在人類和小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)幾種RAGE的變異體，公認的有可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)和內(nèi)源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE，es

6、RAGE)。雖然它們的產(chǎn)生機制及分子大小不盡相同，但由于都包括配體結(jié)合的細胞外區(qū)域而缺乏跨膜區(qū)域，因此能與RAGE競爭同RAGE配體的結(jié)合，并阻斷RAGE信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？扇苄訰AGE(sRAGE)存在于循環(huán)中，由RAGE的胞外段構(gòu)成；sRAGE包括esRAGE和RAGE蛋白水解裂解的形式。在晚期腎臟疾病和急性肺損傷中sRAGE水平升高。在類風濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病、老年性癡呆和原發(fā)性高血壓中sRAGE水平降低。目前，有研究提示重癥

7、急性胰腺炎是否合并器官衰竭時，sRAGE水平顯著不同。
　　 高遷移率族蛋白B1(hjgh mobility group box—1，HMGB1)是RAGE的主要配體之一，是一種DNA結(jié)合蛋白，又稱兩性蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一的能在細胞外誘導(dǎo)細胞因子和活化炎癥細胞的核內(nèi)蛋白。HMGB1具有3個結(jié)構(gòu)域，即A、B、C區(qū)，A和B區(qū)主要構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū)；C區(qū)可與其它蛋白

8、相互作用來調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力。HMGB1分布十分廣泛，在多種器官組織(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細胞中均有表達，它通過兩種不同的途徑釋放至細胞外：活化炎癥細胞的主動分泌和壞死細胞的被動釋放。最近的研究表明細胞外的HMGB1可作為一種晚期炎癥因子參與膿毒癥的病理生理，并且在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatits，SAP)從全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory r

9、esponse syndrome，SIRS)到多器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)的過程中起到非常重要的作用。而且與其它促炎因子如腫瘤壞死因子—a(tumornecrosis factor—alpha，TNF—a)和白介素—1(interleukin—1，IL—1)不同，HMGB1具有出現(xiàn)晚，但持續(xù)時間長

10、的特點，從而擴大了臨床治療的時間窗。
　　 目前國內(nèi)外關(guān)于重癥急性胰腺炎與RAGE及其配體HMGB1的研究較少，為明確RAGE在重癥急性胰腺炎發(fā)病中的作用，我們擬建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察重癥急性胰腺炎造模成功后大鼠胰腺組織內(nèi)RAGE及其配體HMGB1在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的變化，同時通過ELISA法檢測血清中sRAGE和HMGB1這兩種炎癥因子水平。這一研究不僅為臨床治療重癥急性胰腺炎提供新的思路，而且也對其他有炎癥機制參與的

11、急性損傷性疾病提供借鑒和參考。
　　 一、大鼠重癥急性胰腺炎模型的建立
　　 目的：制備SAP動物模型，了解大鼠SAP病程規(guī)律，為下一步實驗研究提供基礎(chǔ)。
　　 萬法：將64只雄性SD大鼠隨機分為8組，用生理鹽水配置20％L—精氨酸溶液，利用腹腔注射的方法，按照250mg/100g的劑量，間隔一小時重復(fù)注射一次，制備SAP模型，對照組SD大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模后6h，18h，24h，36h，48h，72k

12、，96h分批處死大鼠，心臟采血，室溫靜置后離心分離血清，分裝后放置于—80℃冰箱低溫保存。同時留取胰腺、肝臟、肺臟、腸道組織。測定血清淀粉酶(serum amylase，AMY)，染色觀察胰腺組織、肺臟病理學變化并評分。
　　 結(jié)果：造模后6h起，血清淀粉酶水平就開始升高，其中SAP18h組血清淀粉酶水平顯著高于其他各組。大鼠SAP模型各時間點腹水量隨著病情進展逐漸增多，至SAP96h組腹水量達到最高水平。光鏡下，對照組胰腺組織

13、結(jié)構(gòu)清晰，腺泡結(jié)構(gòu)完整，小葉間隔清晰，有輕度水腫，無炎細胞浸潤及出血、壞死。大鼠造模后6h起，胰腺病理評分顯著升高，SAP6h組胰腺組織出現(xiàn)間質(zhì)水腫，有輕、中度的炎細胞浸潤，以中性粒為主，腺泡結(jié)構(gòu)尚好，組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞。SAP18h組胰腺間質(zhì)顯著水腫，有大量炎細胞浸潤，有輕度的實質(zhì)壞死和出血。SAP24h組胰腺腺泡細胞腫脹，可見灶性壞死，腺泡細胞間有大量炎癥細胞浸潤，胰腺實質(zhì)內(nèi)紅細胞滲出較多，胰腺壞死、出血較18h明顯。SAP36h組

14、腺泡結(jié)構(gòu)破壞較多，小葉排列紊亂，其間充斥大量炎性滲出，壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失。SAP48h組腺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，胰腺組織大片破壞，周圍脂肪組織明顯充血，大量炎癥細胞浸潤。SAP72h組壞死加重，腺泡結(jié)構(gòu)消失，壞死區(qū)HE染色為粉紅色無結(jié)構(gòu)區(qū)域，胞核溶解，葉間隙增寬，間質(zhì)微血管破裂，大量紅細胞溢出，片狀脂肪壞死形成，可見皂化斑。SAP96h組胰腺組織壞死達到最高程度。光鏡下，對照組大鼠肺泡壁完整，肺間質(zhì)無炎細胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)清晰。SAP24h

15、組肺臟間質(zhì)增寬，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)淡紅色滲液，伴有肺泡萎縮，肺泡及間質(zhì)有大量中性粒細胞浸潤。SAP36h組肺泡間質(zhì)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)顯著充血、水腫，有大量炎細胞浸潤。SAP48h、SAP72h、SAP96h組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破裂，肺泡腔出血明顯，肺泡間隔顯著增寬，大部分肺泡和間質(zhì)中有中性粒細胞浸潤，結(jié)構(gòu)損害嚴重。
　　 結(jié)論：腹腔注射20％L—精氨酸溶液制備大鼠重癥急性胰腺炎模型，具有操作簡便，快捷，對動物創(chuàng)傷性小，可重復(fù)性好，模

16、型穩(wěn)定，成功率高等優(yōu)點，是一種較理想的模型，為進一步開展SAP致病機制相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 二、RAGE在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達
　　 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織中RAGE及血清中sRAGE含量變化的規(guī)律。
　　 方法：按照各時間點處死大鼠，無菌條件下留取胰腺組織，抽提總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT—PCR)擴增出大鼠RAGE，擴增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致。用實時定量PCR(real—

17、time PCR)的方法檢測胰腺組織RAGE mRNA表達；免疫組化法(Immunohistochemisty，IHC)檢測SAP不同時段組大鼠胰腺組織中RAGE蛋白表達；采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme—linked immunosorbent adsorption method，ELISA)檢測血清中sRAGE水平。
　　 結(jié)果：實時定量PCR方法檢測RAGE在mRNA水平的表達，統(tǒng)計結(jié)果顯示SAP6h組、SAP18h組、S

18、AP24h組、SAP36h組、SAP48h組、SAP72h組及SAP96h組RAGE在胰腺組織中的相對表達量顯著高于對照組(P<0．05)，其中SAP24h組及SAP36h組RAGE在胰腺組織中的相對表達量顯著高于其他時相組(P<0．05)，之后有降低趨勢。IHC從蛋白水平顯示SAP48h組胰腺組織炎癥細胞胞膜及胞漿中有RAGE的表達，對照組無表達。本實驗還通過RAGE ELISA試劑盒測定血清中sRAGE含量，結(jié)果顯示對照組血清中sR

19、AGE濃度較低，SAP6h組sRAGE濃度開始升高，與對照組比較有明顯差異(P<0．05)；SAP18h組sRAGE濃度明顯升高，SAP24h組sRAGE濃度達峰值，與其他各組相比有顯著差異(P<0．05)；24h后，血清中sRAGE濃度開始下降，但SAP36h組及SAP48h組sRAGE濃度仍維持在相對較高的水平，SAP96h組sRAGE濃度下降至接近基線水平，與對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。
　　 結(jié)論：R

20、AGE在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，組織和血清中的RAGE表達呈時間依賴性，血清中RAGE的表達可部分反映SAP的病程。
　　 三、HMGB1在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達
　　 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織及血清中RAGE配體HMGB1蛋白的變化規(guī)律
　　 方法：按照各時間點處死大鼠，無菌條件下留取胰腺組織，抽提總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT—PCR)擴增出大鼠HMGB1，擴增產(chǎn)

21、物與預(yù)期目的基因一致。用real—time PCR的方法檢測胰腺組織HMGB1 mRNA表達；IHC檢測SAP不同時段組大鼠胰腺組織中HMGB1蛋白表達；采用ELISA檢測血清中HMGB1水平。
　　 結(jié)果：實時定量PCR方法檢測HMGB1在mRNA水平的表達，統(tǒng)計結(jié)果顯示SAP6h組、SAP18h組、SAP24h組、SAP36h組、SAP48h組、SAP72h組及SAP96h組HMGB1在胰腺組織中的相對表達量顯著高于對照組(

22、P<0．05)，其中SAP36h組HMGB1在胰腺組織中的相對表達量顯著高于其他組(P<0．05)。IHC從蛋白水平顯示SAP36h組大鼠胰腺腺泡細胞及炎癥細胞胞漿、胞核及胰腺間質(zhì)中有HMGB1蛋白表達，對照組無表達。本實驗還通過HMGB1 ELISA試劑盒測定血清中HMGB1含量，結(jié)果顯示對照組血清中HMGB1濃度較低，SAP6h組HMGB1濃度開始升高，與對照組比較有明顯差異(P<0．05)；SAP18h組及SAP24h組HMGB1

23、濃度明顯升高，SAP36h組HMGB1濃度達峰值，與其他各組相比有顯著差異(P<0．05)；36h后，血清中HMGB1濃度開始下降，但SAP48h組及SAP72h組HMGB1濃度仍維持在相對較高的水平，SAP96h組HMGB1濃度下降至接近基線水平，與對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。
　　 結(jié)論：HMGB1可能作為晚期炎癥因子參與了重癥急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng)，且其在血清中出現(xiàn)的時相晚于其受體RAGE。