晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其配體HMGB1在大鼠重癥急性胰腺炎發(fā)病中的作用研究.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床的危重急癥，大多數(shù)患者是輕癥胰腺炎，且為自限性，通常在發(fā)病數(shù)日后可好轉(zhuǎn)；但仍有約20％—30％的患者表現(xiàn)為重癥急性胰腺炎。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)以全身炎癥反應(yīng)綜合癥、多器官功能衰竭及胰腺局部并發(fā)癥為特征，盡管臨床治療方法不斷改善，但目前病死率仍高達(dá)15—30％。早期階段的多器官功能衰竭及后期感染等并發(fā)癥是導(dǎo)致重癥急性胰腺炎

2、高死亡率的主要原因。多器官功能衰竭是全身性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，值得注意的是過度激活的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放的炎癥因子可能導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官的損傷。在重癥急性胰腺炎的發(fā)病過程中，胰腺局部、以及全身性炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用。深入認(rèn)識(shí)和研究重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)機(jī)制，對(duì)于其治療方法的探索一直是研究的熱點(diǎn)。
　　 SAP的一個(gè)重要問題是尚沒有一個(gè)特異的血清學(xué)或者其他指標(biāo)來診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后，進(jìn)而指導(dǎo)治療。目前臨床上已有通過檢測(cè)血清淀粉酶

3、和C—反應(yīng)蛋白等判斷SAP預(yù)后，但是應(yīng)用價(jià)值非常有限。
　　 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)，屬于細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族多配體受體成員，廣泛分布在單核—巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面：晚期糖基化終末產(chǎn)物受體是介導(dǎo)HMGB1細(xì)胞因子活性的重要受體。除HMGB1，其

4、配體還包括糖基化終末產(chǎn)物、β淀粉樣肽、S100蛋白等。RAGE與其配體相互作用常導(dǎo)致快速持續(xù)的細(xì)胞活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，多種細(xì)胞信號(hào)ERK1/2(p44/p42)、p38和SAPK/JNK MAP激酶，rho—GTP酶類，磷酸肌醇—3—激酶和JAK/STAT信號(hào)途徑在不同類型細(xì)胞中被激活，并通過核因子—kappaB(NuclearFactor—kappaB，NF—kB)持久活化維持和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。有報(bào)道指出，RAGE敲除小鼠能耐受盲腸結(jié)扎

5、穿孔引起的感染性休克，表明RAGE在系統(tǒng)性急性炎癥過程中發(fā)揮重要作用。
　　 RAGE屬于單跨膜片段受體，分為胞外段、疏水的跨膜區(qū)和胞內(nèi)段3部分：其胞外部分包含了一個(gè)“V”型區(qū)和兩個(gè)“C”型區(qū)，與HMGB1結(jié)合的主要部位位于N端的“V”型區(qū)。最近，在人類和小鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)幾種RAGE的變異體，公認(rèn)的有可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)和內(nèi)源性分泌型RAGE(endogenous secretory RAGE，es

6、RAGE)。雖然它們的產(chǎn)生機(jī)制及分子大小不盡相同，但由于都包括配體結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)域而缺乏跨膜區(qū)域，因此能與RAGE競(jìng)爭(zhēng)同RAGE配體的結(jié)合，并阻斷RAGE信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？扇苄訰AGE(sRAGE)存在于循環(huán)中，由RAGE的胞外段構(gòu)成；sRAGE包括esRAGE和RAGE蛋白水解裂解的形式。在晚期腎臟疾病和急性肺損傷中sRAGE水平升高。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病、老年性癡呆和原發(fā)性高血壓中sRAGE水平降低。目前，有研究提示重癥

7、急性胰腺炎是否合并器官衰竭時(shí)，sRAGE水平顯著不同。
　　 高遷移率族蛋白B1(hjgh mobility group box—1，HMGB1)是RAGE的主要配體之一，是一種DNA結(jié)合蛋白，又稱兩性蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)的快速遷移而得名，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一的能在細(xì)胞外誘導(dǎo)細(xì)胞因子和活化炎癥細(xì)胞的核內(nèi)蛋白。HMGB1具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即A、B、C區(qū)，A和B區(qū)主要構(gòu)成HMGB1的非特異性DNA結(jié)合區(qū)；C區(qū)可與其它蛋白

8、相互作用來調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的親和力。HMGB1分布十分廣泛，在多種器官組織(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細(xì)胞中均有表達(dá)，它通過兩種不同的途徑釋放至細(xì)胞外：活化炎癥細(xì)胞的主動(dòng)分泌和壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放。最近的研究表明細(xì)胞外的HMGB1可作為一種晚期炎癥因子參與膿毒癥的病理生理，并且在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatits，SAP)從全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory r

9、esponse syndrome，SIRS)到多器官功能不全(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)的過程中起到非常重要的作用。而且與其它促炎因子如腫瘤壞死因子—a(tumornecrosis factor—alpha，TNF—a)和白介素—1(interleukin—1，IL—1)不同，HMGB1具有出現(xiàn)晚，但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)

10、的特點(diǎn)，從而擴(kuò)大了臨床治療的時(shí)間窗。
　　 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于重癥急性胰腺炎與RAGE及其配體HMGB1的研究較少，為明確RAGE在重癥急性胰腺炎發(fā)病中的作用，我們擬建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察重癥急性胰腺炎造模成功后大鼠胰腺組織內(nèi)RAGE及其配體HMGB1在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的變化，同時(shí)通過ELISA法檢測(cè)血清中sRAGE和HMGB1這兩種炎癥因子水平。這一研究不僅為臨床治療重癥急性胰腺炎提供新的思路，而且也對(duì)其他有炎癥機(jī)制參與的

11、急性損傷性疾病提供借鑒和參考。
　　 一、大鼠重癥急性胰腺炎模型的建立
　　 目的：制備SAP動(dòng)物模型，了解大鼠SAP病程規(guī)律，為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。
　　 萬法：將64只雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組，用生理鹽水配置20％L—精氨酸溶液，利用腹腔注射的方法，按照250mg/100g的劑量，間隔一小時(shí)重復(fù)注射一次，制備SAP模型，對(duì)照組SD大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模后6h，18h，24h，36h，48h，72k

12、，96h分批處死大鼠，心臟采血，室溫靜置后離心分離血清，分裝后放置于—80℃冰箱低溫保存。同時(shí)留取胰腺、肝臟、肺臟、腸道組織。測(cè)定血清淀粉酶(serum amylase，AMY)，染色觀察胰腺組織、肺臟病理學(xué)變化并評(píng)分。
　　 結(jié)果：造模后6h起，血清淀粉酶水平就開始升高，其中SAP18h組血清淀粉酶水平顯著高于其他各組。大鼠SAP模型各時(shí)間點(diǎn)腹水量隨著病情進(jìn)展逐漸增多，至SAP96h組腹水量達(dá)到最高水平。光鏡下，對(duì)照組胰腺組織

13、結(jié)構(gòu)清晰，腺泡結(jié)構(gòu)完整，小葉間隔清晰，有輕度水腫，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)及出血、壞死。大鼠造模后6h起，胰腺病理評(píng)分顯著升高，SAP6h組胰腺組織出現(xiàn)間質(zhì)水腫，有輕、中度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒為主，腺泡結(jié)構(gòu)尚好，組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞。SAP18h組胰腺間質(zhì)顯著水腫，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有輕度的實(shí)質(zhì)壞死和出血。SAP24h組胰腺腺泡細(xì)胞腫脹，可見灶性壞死，腺泡細(xì)胞間有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出較多，胰腺壞死、出血較18h明顯。SAP36h組

14、腺泡結(jié)構(gòu)破壞較多，小葉排列紊亂，其間充斥大量炎性滲出，壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失。SAP48h組腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，胰腺組織大片破壞，周圍脂肪組織明顯充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。SAP72h組壞死加重，腺泡結(jié)構(gòu)消失，壞死區(qū)HE染色為粉紅色無結(jié)構(gòu)區(qū)域，胞核溶解，葉間隙增寬，間質(zhì)微血管破裂，大量紅細(xì)胞溢出，片狀脂肪壞死形成，可見皂化斑。SAP96h組胰腺組織壞死達(dá)到最高程度。光鏡下，對(duì)照組大鼠肺泡壁完整，肺間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織結(jié)構(gòu)清晰。SAP24h

15、組肺臟間質(zhì)增寬，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)淡紅色滲液，伴有肺泡萎縮，肺泡及間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。SAP36h組肺泡間質(zhì)明顯增寬，肺泡腔內(nèi)顯著充血、水腫，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。SAP48h、SAP72h、SAP96h組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破裂，肺泡腔出血明顯，肺泡間隔顯著增寬，大部分肺泡和間質(zhì)中有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重。
　　 結(jié)論：腹腔注射20％L—精氨酸溶液制備大鼠重癥急性胰腺炎模型，具有操作簡(jiǎn)便，快捷，對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷性小，可重復(fù)性好，模

16、型穩(wěn)定，成功率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的模型，為進(jìn)一步開展SAP致病機(jī)制相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 二、RAGE在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達(dá)
　　 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織中RAGE及血清中sRAGE含量變化的規(guī)律。
　　 方法：按照各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，無菌條件下留取胰腺組織，抽提總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)擴(kuò)增出大鼠RAGE，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致。用實(shí)時(shí)定量PCR(real—

17、time PCR)的方法檢測(cè)胰腺組織RAGE mRNA表達(dá)；免疫組化法(Immunohistochemisty，IHC)檢測(cè)SAP不同時(shí)段組大鼠胰腺組織中RAGE蛋白表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme—linked immunosorbent adsorption method，ELISA)檢測(cè)血清中sRAGE水平。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)RAGE在mRNA水平的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示SAP6h組、SAP18h組、S

18、AP24h組、SAP36h組、SAP48h組、SAP72h組及SAP96h組RAGE在胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0．05)，其中SAP24h組及SAP36h組RAGE在胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他時(shí)相組(P<0．05)，之后有降低趨勢(shì)。IHC從蛋白水平顯示SAP48h組胰腺組織炎癥細(xì)胞胞膜及胞漿中有RAGE的表達(dá)，對(duì)照組無表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還通過RAGE ELISA試劑盒測(cè)定血清中sRAGE含量，結(jié)果顯示對(duì)照組血清中sR

19、AGE濃度較低，SAP6h組sRAGE濃度開始升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0．05)；SAP18h組sRAGE濃度明顯升高，SAP24h組sRAGE濃度達(dá)峰值，與其他各組相比有顯著差異(P<0．05)；24h后，血清中sRAGE濃度開始下降，但SAP36h組及SAP48h組sRAGE濃度仍維持在相對(duì)較高的水平，SAP96h組sRAGE濃度下降至接近基線水平，與對(duì)照組相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。
　　 結(jié)論：R

20、AGE在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，組織和血清中的RAGE表達(dá)呈時(shí)間依賴性，血清中RAGE的表達(dá)可部分反映SAP的病程。
　　 三、HMGB1在大鼠重癥急性胰腺炎中的表達(dá)
　　 目的：研究大鼠SAP發(fā)病過程中胰腺組織及血清中RAGE配體HMGB1蛋白的變化規(guī)律
　　 方法：按照各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，無菌條件下留取胰腺組織，抽提總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)擴(kuò)增出大鼠HMGB1，擴(kuò)增產(chǎn)

21、物與預(yù)期目的基因一致。用real—time PCR的方法檢測(cè)胰腺組織HMGB1 mRNA表達(dá)；IHC檢測(cè)SAP不同時(shí)段組大鼠胰腺組織中HMGB1蛋白表達(dá)；采用ELISA檢測(cè)血清中HMGB1水平。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)HMGB1在mRNA水平的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示SAP6h組、SAP18h組、SAP24h組、SAP36h組、SAP48h組、SAP72h組及SAP96h組HMGB1在胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(

22、P<0．05)，其中SAP36h組HMGB1在胰腺組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組(P<0．05)。IHC從蛋白水平顯示SAP36h組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞及炎癥細(xì)胞胞漿、胞核及胰腺間質(zhì)中有HMGB1蛋白表達(dá)，對(duì)照組無表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還通過HMGB1 ELISA試劑盒測(cè)定血清中HMGB1含量，結(jié)果顯示對(duì)照組血清中HMGB1濃度較低，SAP6h組HMGB1濃度開始升高，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0．05)；SAP18h組及SAP24h組HMGB1

23、濃度明顯升高，SAP36h組HMGB1濃度達(dá)峰值，與其他各組相比有顯著差異(P<0．05)；36h后，血清中HMGB1濃度開始下降，但SAP48h組及SAP72h組HMGB1濃度仍維持在相對(duì)較高的水平，SAP96h組HMGB1濃度下降至接近基線水平，與對(duì)照組相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。
　　 結(jié)論：HMGB1可能作為晚期炎癥因子參與了重癥急性胰腺炎的全身炎癥反應(yīng)，且其在血清中出現(xiàn)的時(shí)相晚于其受體RAGE。