microRNA-203通過(guò)APC介導(dǎo)活化Wnt-β-catenin信號(hào)通路在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的以滑膜增生、炎癥反應(yīng)、軟骨降解以及骨破壞為特征的慢性、進(jìn)行性、系統(tǒng)性、炎癥性關(guān)節(jié)病。眾所周知，成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)的異?；罨诨ぱ装Y和關(guān)節(jié)破壞的起始階段以及進(jìn)行性發(fā)展階段都起到重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道顯示在RA FLS中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化在一定程度上參與控制FLS的活化從而導(dǎo)

2、致RA的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路的活化在多種不同層面受到許多各種不同的在生物學(xué)進(jìn)化上相對(duì)保守的效應(yīng)蛋白的調(diào)控。腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)參與組成的蛋白降解復(fù)合物用于控制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄輔激活物β-catenin蛋白的量，因突變或者其他包括 DNA甲基化和microRNAs等在內(nèi)的表觀遺傳學(xué)修飾的原因使得APC的表達(dá)異常的情況在多種人類疾病中被檢測(cè)到。
　　Mi

3、croRNAs(miRNA)是一類19-23核苷酸長(zhǎng)度的短的內(nèi)生的單鏈非編碼RNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)參與調(diào)控包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程。近幾年已經(jīng)在RA的外周血單核細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種異常表達(dá)的 miRNA,但是參與調(diào)控此過(guò)程的具體機(jī)制以及異常表達(dá)的miRNA通過(guò)何種機(jī)制參與調(diào)控RA的發(fā)生發(fā)展目前還不明確。
　　因佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)病理特

4、征與RA相似，本研究選擇AA模型作為動(dòng)物研究對(duì)象，F(xiàn)LS作為細(xì)胞研究對(duì)象，目的在于探討異常表達(dá)的miRNA-203與wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子APC之間的關(guān)系以及miRNA-203與APC表達(dá)異常在RA中的作用及其可能的機(jī)制。
　　主要研究?jī)?nèi)容概括如下：
　　1． AA大鼠FLS中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化
　　通過(guò)左后足趾皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑造AA大鼠模型。Western blot結(jié)果顯示與正常組相比在

5、來(lái)源于AA大鼠滑膜的FLS中存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化，β-catenin、 c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)增加，內(nèi)源性負(fù)調(diào)控蛋白APC的蛋白表達(dá)降低。
　　2．APC在FLS活化過(guò)程中的作用
　　為了闡明APC在FLS活化過(guò)程中的作用，通過(guò)在來(lái)源于正常大鼠滑膜的FLS中轉(zhuǎn)染特異性靶向大鼠APC的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）降低APC的表達(dá)，結(jié)果顯示下調(diào)

6、APC能夠促進(jìn)FLS增殖，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin的 mRNA水平無(wú)明顯改變而蛋白表達(dá)水平明顯增加并且Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白水平均明顯升高，提示下調(diào) APC的表達(dá)可能通過(guò)減少β-catenin的降解而活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而在FLS的活化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3．miRNA-203與APC的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)<

7、br>　　應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) miR-203潛在的作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的內(nèi)源性負(fù)調(diào)控基因APC的mRNA的3?非編碼區(qū)上存在miR-203的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)Q-PCR結(jié)果顯示miR-203在AA大鼠的FLS中的表達(dá)明顯高于正常組，提示在AA FLS中異常高表達(dá)的miR-203可能通過(guò)靶向調(diào)控APC的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，參與調(diào)控AA的發(fā)生發(fā)展。
　　4. miRN

8、A-203在FLS活化過(guò)程中的作用
　　為了闡明在AA大鼠FLS中異常高表達(dá)的miR-203對(duì)FLS的活化以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中的作用并驗(yàn)證miR-203與APC之間的靶向關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先在正常組的FLS中轉(zhuǎn)染特異性的miR-203 mimics上調(diào)miR-203的表達(dá)，MTT結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-203能夠明顯促進(jìn)FLS的增殖，上調(diào)miR-203的表達(dá)亦能明顯抑制APC蛋白的表達(dá)，APC蛋白的表達(dá)減少導(dǎo)致β-catenin

9、蛋白降解減少，β-catenin的蛋白表達(dá)水平增加，同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄因子活化，c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，在AA組FLS中轉(zhuǎn)染miR-203 inhibitor減少miR-203的表達(dá)也能通過(guò)增加APC的表達(dá)從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。然而，當(dāng)在AA組FLS中轉(zhuǎn)染靶向大鼠APC基因的siRNA后再給予細(xì)胞miR-203 inhibitor處理并不能抑制W

10、nt/β-catenin信號(hào)通路的活化，進(jìn)一步驗(yàn)證了異常表達(dá)的miR-203可能是通過(guò)靶向APC來(lái)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化進(jìn)而參與調(diào)控AA的發(fā)生發(fā)展。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明在AA FLS中表達(dá)減少的APC可能通過(guò)抑制泛素依賴的β-catenin的降解，進(jìn)而活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控FLS的異?；罨^(guò)程，此外，研究還發(fā)現(xiàn)APC的表達(dá)減少可能與AA FLS中miR-203異常高表達(dá)有關(guān)，