microRNA-203通過APC介導活化Wnt-β-catenin信號通路在佐劑性關節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞中的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的以滑膜增生、炎癥反應、軟骨降解以及骨破壞為特征的慢性、進行性、系統(tǒng)性、炎癥性關節(jié)病。眾所周知，成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)的異?；罨诨ぱ装Y和關節(jié)破壞的起始階段以及進行性發(fā)展階段都起到重要作用。文獻報道顯示在RA FLS中Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨谝欢ǔ潭壬蠀⑴c控制FLS的活化從而導

2、致RA的發(fā)生。Wnt信號通路的活化在多種不同層面受到許多各種不同的在生物學進化上相對保守的效應蛋白的調(diào)控。腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)參與組成的蛋白降解復合物用于控制細胞質(zhì)內(nèi)游離的Wnt信號通路的轉(zhuǎn)錄輔激活物β-catenin蛋白的量，因突變或者其他包括 DNA甲基化和microRNAs等在內(nèi)的表觀遺傳學修飾的原因使得APC的表達異常的情況在多種人類疾病中被檢測到。
　　Mi

3、croRNAs(miRNA)是一類19-23核苷酸長度的短的內(nèi)生的單鏈非編碼RNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達參與調(diào)控包括細胞周期、細胞分化、增殖、凋亡等在內(nèi)的多種生物學過程。近幾年已經(jīng)在RA的外周血單核細胞、成纖維樣滑膜細胞中發(fā)現(xiàn)多種異常表達的 miRNA,但是參與調(diào)控此過程的具體機制以及異常表達的miRNA通過何種機制參與調(diào)控RA的發(fā)生發(fā)展目前還不明確。
　　因佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)病理特

4、征與RA相似，本研究選擇AA模型作為動物研究對象，F(xiàn)LS作為細胞研究對象，目的在于探討異常表達的miRNA-203與wnt信號通路的負調(diào)控因子APC之間的關系以及miRNA-203與APC表達異常在RA中的作用及其可能的機制。
　　主要研究內(nèi)容概括如下：
　　1． AA大鼠FLS中Wnt/β-catenin信號通路的變化
　　通過左后足趾皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑造AA大鼠模型。Western blot結(jié)果顯示與正常組相比在

5、來源于AA大鼠滑膜的FLS中存在Wnt/β-catenin信號通路的異常活化，β-catenin、 c-myc和cyclinD1的蛋白表達增加，內(nèi)源性負調(diào)控蛋白APC的蛋白表達降低。
　　2．APC在FLS活化過程中的作用
　　為了闡明APC在FLS活化過程中的作用，通過在來源于正常大鼠滑膜的FLS中轉(zhuǎn)染特異性靶向大鼠APC的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）降低APC的表達，結(jié)果顯示下調(diào)

6、APC能夠促進FLS增殖，Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白β-catenin的 mRNA水平無明顯改變而蛋白表達水平明顯增加并且Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白水平均明顯升高，提示下調(diào) APC的表達可能通過減少β-catenin的降解而活化Wnt/β-catenin信號通路進而在FLS的活化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3．miRNA-203與APC的靶向關系預測<

7、br>　　應用生物信息學軟件預測 miR-203潛在的作用靶點，結(jié)果顯示 Wnt/β-catenin信號通路的內(nèi)源性負調(diào)控基因APC的mRNA的3?非編碼區(qū)上存在miR-203的結(jié)合位點，同時Q-PCR結(jié)果顯示miR-203在AA大鼠的FLS中的表達明顯高于正常組，提示在AA FLS中異常高表達的miR-203可能通過靶向調(diào)控APC的表達進而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的活化，參與調(diào)控AA的發(fā)生發(fā)展。
　　4. miRN

8、A-203在FLS活化過程中的作用
　　為了闡明在AA大鼠FLS中異常高表達的miR-203對FLS的活化以及風濕性關節(jié)炎的發(fā)病機制中的作用并驗證miR-203與APC之間的靶向關系，本實驗首先在正常組的FLS中轉(zhuǎn)染特異性的miR-203 mimics上調(diào)miR-203的表達，MTT結(jié)果顯示過表達miR-203能夠明顯促進FLS的增殖，上調(diào)miR-203的表達亦能明顯抑制APC蛋白的表達，APC蛋白的表達減少導致β-catenin

9、蛋白降解減少，β-catenin的蛋白表達水平增加，同時Wnt/β-catenin信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子活化，c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表達水平增加，在AA組FLS中轉(zhuǎn)染miR-203 inhibitor減少miR-203的表達也能通過增加APC的表達從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化。然而，當在AA組FLS中轉(zhuǎn)染靶向大鼠APC基因的siRNA后再給予細胞miR-203 inhibitor處理并不能抑制W

10、nt/β-catenin信號通路的活化，進一步驗證了異常表達的miR-203可能是通過靶向APC來調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的活化進而參與調(diào)控AA的發(fā)生發(fā)展。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明在AA FLS中表達減少的APC可能通過抑制泛素依賴的β-catenin的降解，進而活化Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控FLS的異常活化過程，此外，研究還發(fā)現(xiàn)APC的表達減少可能與AA FLS中miR-203異常高表達有關，