Dishevelled2通過交叉調(diào)控NF-κB通路對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)最主要的病理改變是滑膜炎，以滑膜細(xì)胞凋亡減少、腫瘤樣生長及炎性介質(zhì)大量分泌為特征，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨侵蝕，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不可逆破壞從而致殘。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocyte，F(xiàn)LS)是關(guān)節(jié)滑膜的重要組成部分，是上述病理過程的重要參與者。RA-FLS的激活與多條信號(hào)通路有關(guān)，其中最為經(jīng)典的信號(hào)通路便是NF-κB信號(hào)通路。在RA-FLS

2、中，NF-κB通路被明顯激活后其下游靶基因(如cIAP1、cIAP2、IL-1，IL-6)的表達(dá)增加使得RA-FLS抗凋亡能力以及炎癥因子、粘附分子、基質(zhì)降解酶的分泌能力明顯升高。除了NF-κB信號(hào)通路外，Wnt信號(hào)通路在RA中的作用也是近年來研究的熱點(diǎn)，有證據(jù)顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路在RA中也處于激活狀態(tài)，參與了RA-FLS的活化。巢亂蛋白(Dishevelled，Dvl)是處在Wnt信號(hào)通路中游的關(guān)鍵的信號(hào)蛋白分子，是非常重要而有趣的分子

3、。Dvl有三種的同型異構(gòu)體(Dvl1，DVL2，Dvl3)和4個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域(DIX域、PDZ域、DEP域以及DSV)。Dvl不僅是經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路的分線器，也可以與其他信號(hào)通路上的幾十種蛋白相互作用，所以也是Wnt通路與BMP、mTOR等多條信號(hào)通路的交匯點(diǎn)。盡管在腫瘤中已經(jīng)有一些關(guān)于Dvl蛋白的研究，但是目前在RA中還沒有關(guān)于Dvl蛋白表達(dá)及功能的相關(guān)研究。因此，本研究著重探討了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中的表達(dá)情

4、況以及其對(duì)RA-FLS凋亡和炎癥因子分泌的影響和相關(guān)分子機(jī)制。
　　一、DVL2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織及RA-FLS中處于高表達(dá)狀態(tài)
　　首先，我們與關(guān)節(jié)外科合作，獲取了RA、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)及正常創(chuàng)傷(Trauma)患者的滑膜組織，通過免疫組織化學(xué)(IHC)、蛋白質(zhì)印記(WB)等方法檢測(cè)了DVL2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管DVL2蛋白的表達(dá)在RA與OA中沒有顯著差異，但是RA滑膜組織中的DV

5、L2蛋白表達(dá)量明顯高于Trauma患者，提示DVL2可能通過Wnt通路參與RA滑膜的增殖。另外，從滑膜組織中提取原代FLS后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果同樣顯示DVL2在RA-FLS中的表達(dá)高于Trauma-FLS?；そM織的IHC和RA-FLS的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示DVL2在FLS的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　二、DVL2在體內(nèi)可促進(jìn)RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌
　　在明確了DVL2在RA滑膜組織和RA-FLS中呈高表達(dá)狀

6、態(tài)后，為了對(duì)其功能做進(jìn)一步的研究，我們建立了膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠(CIA)模型，并構(gòu)建了人源DVL2慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒(LV-DVL2)，包裝成慢病毒后注入CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中。待DVL2過表達(dá)后觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、及軟骨下骨的變化，并對(duì)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡及炎癥因子分泌情況進(jìn)行檢測(cè)。有趣的是，DVL2在CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中過表達(dá)后非但沒有使滑膜增殖進(jìn)一步加重，反而一定程度上抑制了滑膜炎并對(duì)關(guān)節(jié)起到了一定的保護(hù)作用。對(duì)大鼠的關(guān)節(jié)滑膜和全膝關(guān)節(jié)

7、進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)DVL2可以減輕CIA大鼠滑膜炎;通過對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液進(jìn)行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DVL2可減少CIA大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β、IL-6及IL-8的分泌;Micro-CT檢測(cè)結(jié)果顯示DVL2可以減輕CIA大鼠軟骨下骨的破壞;但是番紅O-固綠染色并未觀察到DVL2可以明顯減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞。進(jìn)一步的TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示DVL2可以明顯增加CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的凋亡，提示DVL2除了可能參與RA滑膜的增殖以外，還可

8、以在體內(nèi)調(diào)控滑膜細(xì)胞的凋亡。
　　三、DVL2在體外也可促進(jìn)RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌
　　為了進(jìn)一步研究DVL2在RA中的功能及可能的作用機(jī)制，我們提取了人源的RA-FLS細(xì)胞并在其中過表達(dá)了DVL2基因，然后進(jìn)行高通量mRNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB通路及TNF通路都出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。因此，我們將DVL2在RA-FLS中過表達(dá)后觀察其對(duì)RA-FLS細(xì)胞活性、凋亡、周期以及炎癥因子分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外過表

9、達(dá)DVL2的RA-FLS細(xì)胞活性明顯下降，在加入TNF-α刺激后這一現(xiàn)象更為明顯;進(jìn)一步對(duì)RA-FLS的凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DVL2可以明顯增加RA-FLS凋亡率并對(duì)細(xì)胞周期造成一定的影響;用ELISA方法對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DVL2可減少RA-FLS分泌的IL-1β、IL-6及IL-8;而這一抑制作用也在加入TNF-α刺激后同樣變得更為明顯。提示DVL2在炎性環(huán)境下可以抵消一部分炎癥反應(yīng)，從而一定程度上遏制RA-FLS

10、的無限增殖。
　　四、DVL2通過抑制NF-κB通路影響RA-FLS凋亡和炎癥因子的分泌
　　結(jié)合上述結(jié)果，我們推測(cè)DVL2可以抑制RA-FLS的增殖及炎癥因子的分泌很有可能是通過抑制NF-κB通路進(jìn)而抑制其調(diào)控基因?qū)崿F(xiàn)的。因此，我們首先通過RT-PCR對(duì)mRNA測(cè)序所得的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DVL2在RA-FLS中過表達(dá)后可以抑制抗凋亡基因A20、GADD45β、和cIAP2的表達(dá)，而對(duì)cIAP1的表達(dá)卻沒有明顯的影

11、響;當(dāng)給予TNF-α刺激后再次對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，RT-PCR結(jié)果顯示DVL2對(duì)A20、cIAP1和cIAP2的表達(dá)起到顯著的抑制作用，但對(duì)GADD45β的表達(dá)卻沒有明顯的影響;DVL2在RA-FLS細(xì)胞中過表達(dá)后IL-6基因表達(dá)明顯下調(diào)，而IL-1β及IL-8的基因表達(dá)卻沒有明顯變化;給予TNF-α刺激后DVL2則可明顯抑制RA-FLS中IL-1β、IL-6以及IL-8基因的表達(dá)。因?yàn)樯鲜隹沟蛲龌蚝脱装Y因子基因均可被NF-κB通路調(diào)控，

12、所以我們推斷DVL2是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)上述功能的。那么DVL2是如何抑制NF-κB通路的呢？首先我們通過Flowsight檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DVL2在RA-FLS中可以抑制P65的入核;通過IP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DVL2在RA-FLS中也可以與P65相互作用，通過ChIP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DVL2與P65相互作用后可以抑制P65與上述靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而減少抗凋亡基因和炎癥因子基因的表達(dá)。
　　綜上所述，本研究從臨床滑膜標(biāo)本的采集到原代細(xì)胞的培養(yǎng)

13、，從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)再到基因?qū)哟蔚母脑?，全面系統(tǒng)的研究了DVL2在RA患者關(guān)節(jié)滑膜原代細(xì)胞中的表達(dá)情況以及DVL2在體內(nèi)體外對(duì)RA-FLS增殖及炎癥因子分泌的影響。除了觀察現(xiàn)象我們還利用mRNA-seq、IP、Flowsight、ChIP等方法對(duì)DVL2的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。發(fā)現(xiàn)雖然DVL2在RA滑膜中處于高表達(dá)狀態(tài)，可能參與了滑膜的腫瘤樣生長，但是DVL2也可以促進(jìn)RA-FLS凋亡并抑制其炎癥因子的分泌。而DVL2之所以