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文檔簡介
1、脂肪肝是奶牛常見病之一,且多發(fā)于圍產(chǎn)期高產(chǎn)奶牛。脂肪肝不僅會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降,而且會誘發(fā)多種其他疾病,給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。最近幾年,奶牛脂肪肝的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,但對于其發(fā)病原因及機制還不明確。雖然很多研究人員對其相關(guān)發(fā)病機理進行了大量的探究,但從細胞水平上,運用分子生物學(xué)技術(shù)手段來研究其發(fā)病機制并不多見。關(guān)于CYP450和NF-κB與奶牛脂肪肝形成關(guān)系的研究較少,其作用機制不甚明確,值得深入探討和研究。
本研
2、究采用膠原酶兩步灌流法,成功的分離培養(yǎng)了奶牛原代肝細胞。用DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性后,采用生化法測定ALT、AST、TG、TC的含量或活性,MTT法測定肝細胞的存活率,油紅O染色法觀察肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量、顏色和大小。根據(jù)以上所測數(shù)據(jù)及對油紅染色圖片的觀察和分析,篩選建立奶牛肝細胞脂肪變性模型的最佳條件。造模成功后,用不同濃度的丹參處理變性肝細胞,檢測肝細胞中ALT、AST、TG、TC、SOD和MDA的含量或活性。采用ELISA法檢
3、測奶牛肝細胞內(nèi)TNF-α的含量,油紅O染色法觀察肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量、顏色和大小,Western blot法檢測肝細胞中NF-κB和CYP450的蛋白表達水平。本試驗旨在探究TNF-α、NF-κB和CYP450與奶牛脂肪肝的相互關(guān)系,揭示脂肪肝的發(fā)病原因及機制,為臨床上疾病的預(yù)防和治療提供參考。
結(jié)果顯示,用膠原酶兩步灌流法分離到的肝細胞,形態(tài)完整,貼壁良好,存活率約94%,可用于本試驗進一步的研究。DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)肝細胞后,根
4、據(jù)所測肝細胞中TG、TC含量變化結(jié)果,MTT法所測細胞存活率及對油紅染色圖片的觀察和分析,最終選定2 mmol/L的DL-乙硫氨酸培養(yǎng)24 h作為最佳的造模條件。丹參處理脂肪變性肝細胞后,能降低ALT、AST、TG、TC和MDA的含量或活性,抑制TNF-α的釋放,增加SOD活性。隨丹參濃度增加和處理時間的延長,CYP450的表達呈逐漸降低的趨勢。24h時,丹參對NF-κB的表達無明顯影響;48h時,隨丹參濃度的增加,NF-κB的表達呈逐
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