甘草酸對CYP450酶的影響及其機制研究.pdf

1、第一章甘草酸對體內(nèi)CYP3A、CYP1A2、CYP2E1及CYP2D6活性的影響
　　 第一部分COCKTAIL方法檢測甘草酸對人體內(nèi)CYP3A、CYP1A2、CYP2E1及CYP2D6活性的影響
　　 背景:細胞色素P450酶系在人體內(nèi)參與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。藥物對細胞色素P450酶活性的影響,是導(dǎo)致藥物相互作用的主要原因之一。甘草及甘草酸制劑的應(yīng)用日益增長,和其它臨床藥物合用的可能性增加?，F(xiàn)有的研究表明

2、甘草及甘草酸對動物體內(nèi)CYP450酶的影響,但是尚無甘草及甘草酸對人體內(nèi)CYP450酶的作用的研究報道。
　　 目的:檢測甘草的主要成分甘草酸對人體內(nèi)CYP3A、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6活性的影響。
　　 方法:應(yīng)用COCKTAIL方法及單點法在人體內(nèi)初步篩查甘草酸對人體內(nèi)CYP3A、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6活性的影響。征集12名健康男性志愿者,加入雙周期交叉實驗,每周期受試者接受甘草酸或

3、安慰劑處理14天,第15天同時服用探藥咪達唑侖、咖啡因、氯唑沙宗和美托洛爾,采集單點外周靜脈血及收集尿樣來檢測各時間點相應(yīng)的藥物及相應(yīng)代謝產(chǎn)物的濃度。
　　 結(jié)果:服用甘草酸兩周使1小時血漿中1-羥基咪達唑侖和咪達唑侖的比值顯著升高,但是卻顯著降低6小時17X/137X的濃度之比以及4小時6-羥基氯唑沙宗/氯唑沙宗的比值;甘草酸處理對0-8小時尿樣中美托洛爾與α-羥基美托洛爾濃度的比值沒有影響.
　　 結(jié)論:口服甘草酸1

4、4天能夠誘導(dǎo)體內(nèi)CYP3A酶活性;對CYP1A2、CYP2E1酶活性有抑制作用。甘草酸的服用對CYP2D6酶活性沒有明顯影響。
　　 第二部分口服甘草酸對體內(nèi)咪達唑侖藥代動力學(xué)的影響
　　 背景:我們第一部分用雞尾酒法和單點法研究顯示甘草酸能夠誘導(dǎo)CYP3A酶,但是由于單點法的限制,甘草酸對CYP3A的誘導(dǎo)程度以及對咪達唑侖的藥代動力學(xué)參數(shù)的影響和可能發(fā)生的臨床藥物相互作用還是未知的。
　　 目的:應(yīng)用CYP3A

5、最經(jīng)典探藥咪達唑侖進一步探討甘草酸對人體內(nèi)CYP3A酶活性的影響,并觀察甘草酸對咪達唑侖藥代動力學(xué)的影響及其可能的甘草酸與咪達唑侖的藥物相互作用。
　　 方法:征集16名健康男性志愿者,加入雙周期交叉實驗,每周期受試者接受甘草酸或安慰劑處理14天,第15天同時服用探藥咪達唑侖7.5mg,收集0-12小時血樣,LC-MS/MS方法檢測血漿中咪達唑侖及其代謝產(chǎn)物1-羥基咪達唑侖的藥物濃度。
　　 結(jié)果:服用甘草酸兩周使咪達唑

6、侖Cmax顯著降低12％;相應(yīng)的咪達唑侖AUC0-∞顯著降低by20.2％。而1-羥基咪達唑侖Cmax明顯升高19.1％;1-羥基咪達唑侖AUC0-∞顯著增加20.3％。對咪達唑侖的藥代動力學(xué)參數(shù)AUC0-∞和Cmax進行生物等效性分析,其90％可信區(qū)間均超出0.8～1.25的生物等效范圍.
　　 結(jié)論:長期的甘草酸的服用誘導(dǎo)體內(nèi)CYP3A酶活性,使體內(nèi)咪達唑侖的藥代動力學(xué)參數(shù)發(fā)生變化,生物等效性分析超出等效范圍具有臨床意義。<

7、br>　　 第二章甘草酸及甘草次酸對人肝微粒體中細胞色素P450酶活性的影響
　　 背景:為了探討其作用機制,我們首先擬在肝微粒體水平探討甘草酸及其水解產(chǎn)物甘草次酸對CYP450酶的直接作用效應(yīng)。
　　 目的:研究甘草酸及甘草次酸對人肝微粒體中CYP1A2、CYP3A4、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6酶活性的影響。
　　 方法:用體外實驗人肝微粒體孵化體系的方法,分別以咖啡因、咪噠唑侖、奧美拉唑、氯

8、唑沙宗、美托洛爾為探針藥,利用HPLC方法測定探針藥與相應(yīng)代謝產(chǎn)物的濃度,以代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率為酶活性指標,評估甘草酸及甘草次酸在人肝微粒體孵化體系中對CYP1A2、CYP3A、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1酶活性的影響。
　　 結(jié)果:在人肝微粒體反應(yīng)體系中,甘草酸對CYP1A2、CYP3A4、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6酶活性均無明顯影響。同時觀察到甘草次酸自10μM濃度開始對CYP3A介導(dǎo)

9、的1羥咪達唑侖的生成和CYP3A4介導(dǎo)的奧美拉唑磺化作用均有明顯抑制效應(yīng),且隨著甘草次酸濃度的升高,對酶的抑制作用加強,其IC50值分別是32.94±9.51、141.28±22.46μM。甘草次酸自25μ濃度開始抑制CYP2C19介導(dǎo)的奧美拉唑羥化作用,IC50值為176.35±22.46μM。酶促動力學(xué)分析,甘草次酸對CYP3A催化的咪達唑侖1'羥化作用的抑制類型為非競爭性抑制,抑制常數(shù)為7.38±0.93μM。
　　 結(jié)論

10、:甘草酸在肝微粒體水平,對CYP1A2、CYP3A、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1酶活性無明顯影響。甘草次酸非競爭性抑制CYP3A介導(dǎo)的咪達唑侖1位羥化活性,對CYP3A4介導(dǎo)的奧美拉唑磺化和CYP2C19介導(dǎo)的羥化有明顯的抑制作用。
　　 第三章甘草酸、甘草次酸通過核受體PXR及CAR對CYP3A4和CYP2C19轉(zhuǎn)錄表達的影響
　　 背景:為進一步探討其體內(nèi)誘導(dǎo)機制,我們擬從核受體PXR、C

11、AR的調(diào)控角度來分析,觀察甘草酸或甘草次酸是否通過核受體影響CYP3A基因表達而使體內(nèi)酶活性增加。肝微粒體實驗觀察到甘草次酸抑制CYP2C19酶活性,為了正確預(yù)測口服甘草酸對體內(nèi)CYP2C19活性的影響,我們也觀察甘草酸或甘草次酸是否通過核受體對CYP2C19的調(diào)控產(chǎn)生影響。
　　 目的:觀察甘草酸及甘草次酸是否通過孕烷核受體PXR或激活組成性核受體CAR途徑,誘導(dǎo)細胞色素CYP3A4、CYP2C19的轉(zhuǎn)錄表達。
　　

12、方法:在人肝腫瘤細胞株HepG2細胞和人結(jié)腸癌細胞株Caco2細胞中,用瞬時轉(zhuǎn)染報告基因試驗檢測甘草酸及甘草次酸對核受體PXR或CAR介導(dǎo)的CYP3A4、CYP2C19的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。同時應(yīng)用Real-time PCR檢驗甘草次酸對高表達PXR/RXRα或CAR/RXRα的腸道上皮腫瘤細胞株中CYP3A4mRNA表達的影響,并應(yīng)用LC-MS/MS方法檢測甘草次酸引起的CYP3A4活性的變化。為揭開并預(yù)測甘草及甘草酸對人體內(nèi)CYP3A4及

13、CYP2C19的影響和作用機制提供有益信息。
　　 結(jié)果:在瞬時轉(zhuǎn)染的報告基因試驗中,甘草酸不通過核受體PXR或CAR對CYP3A4或CYP2C19的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)生影響。而甘草次酸在超高表達PXR和RXRα的腸道腺癌細胞株Caco2細胞中,能夠引起CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達增加,而在超高表達PXR和RXRα的肝臟的肝癌細胞株HepG2細胞中,甘草次酸沒有表現(xiàn)誘導(dǎo)CYP3A4轉(zhuǎn)錄表達的作用。無論在肝臟還是腸道腫瘤細胞株,甘草次酸均表現(xiàn)通

14、過CAR誘導(dǎo)CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達。在同樣的瞬時轉(zhuǎn)染的報告基因檢測系統(tǒng)中,無論是瞬時轉(zhuǎn)染高表達的PXR還是CAR,甘草次酸都沒有表現(xiàn)出對CYP2C19的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　 結(jié)論:甘草酸沒有通過核受體PXR、CAR對CYP3A4和CYP2C19的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)生影響。甘草次酸通過CAR和/或PXR途徑,主要在腸道提高CYP3A4的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 第四章口服甘草酸對體內(nèi)奧美拉唑藥代動力學(xué)的影響
　　 背景:本課題選取奧美

15、拉唑為代表,觀察在臨床合并治療時,甘草酸對治療藥物與其代謝產(chǎn)物藥代動力學(xué)的影響。
　　 目的:用CYP3A4和CYP2C19的共同探藥奧美拉唑觀察人體內(nèi)甘草酸對CYP2C19和CYP3A4酶活性的影響,判斷其效應(yīng)與CYP2C19基因型之間的相關(guān)性,并觀察甘草酸與奧美拉唑的中西藥相互作用。
　　 方法:在297名無血緣關(guān)系漢族男性健康志愿者中分別采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(Polymerase Chain R

16、eaction-RestrictionFragment Length Polymorphism,PCR—RFLP)方法檢測CYP2C19*2或*3基因突變。選取健康受試者18人(野生型CYP2C19*1/*1,n=6;突變雜合子CYP2C19*1/*2or*3,n=6;突變純合子CYP2C19*2/*2or*3,n=6)參加本次平行開放的兩階段隨機交叉臨床試驗。每個階段受試者服用甘草酸制劑(甘草甜素片)或安慰劑150mg,每天2次,連續(xù)

17、服用14天,第15天受試者口服20mg奧美拉唑膠囊1粒,然后采集0-12小時外周靜脈血。用高效液相色譜法測定各時間點血漿中奧美拉唑和代謝產(chǎn)物濃度。
　　 結(jié)果:連續(xù)服用甘草酸14天后,血藥奧美拉唑濃度顯著降低,其代謝產(chǎn)物5-羥奧美拉唑血藥濃度無明顯變化而奧美拉唑砜血藥濃度顯著升高。奧美拉唑與5-羥奧美拉唑的比值在各基因型受試者中無顯著變化。奧美拉唑與奧美拉唑砜的比值在CYP2C19*1/*1受試者中降低了43.93±13.56％