不同種屬動(dòng)物肝微粒體CYP450酶對(duì)鉤吻代謝的影響.pdf

1、目的:中藥鉤吻是世界著名的有毒植物，歷代本草著作對(duì)其都有收載，其使用歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，具有祛風(fēng)攻毒、散結(jié)、止痛的功效?，F(xiàn)代研究表明鉤吻的根、莖、葉均有劇毒，為了更有效和安全的利用鉤吻總生物堿，我們開(kāi)展了半數(shù)致死量的研究。鉤吻素子作為鉤吻植株中含量最高的生物堿，選擇其做為研究對(duì)象，進(jìn)行豬、羊和小鼠肝臟微粒體對(duì)其代謝表征的比較研究，可以初步揭示其肝臟解毒的部分機(jī)制所在。由于發(fā)現(xiàn)豬羊與小鼠對(duì)鉤吻的代謝存在不同之處，故運(yùn)用細(xì)胞色素P450酶活性的異

2、同來(lái)初步揭示三者之間的機(jī)制的異同。方法本課題首先將閩產(chǎn)鉤吻根粉碎后用95％乙醇提取，減壓下回收乙醇，加2％鹽酸溶解后用氯仿萃取，濃氨水堿化水層，再用氯仿萃取，得到鉤吻根總生物堿。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將40只小鼠分成4組，每組10只，按照5.5 mg/kg、4.4 mg/kg、3.52 mg/kg、2.82 mg/kg的劑量一次性灌服小鼠后觀察24 h內(nèi)的情況。通過(guò)記錄小鼠臨床癥狀及死亡情況，觀察閩產(chǎn)鉤吻根總生物堿的急性毒性并用孫氏改良寇氏法計(jì)

3、算LD50及其95％的可信區(qū)間。同時(shí)本課題采用Bradford法蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒方法和Omura法對(duì)小鼠、豬以及羊肝微粒體的蛋白質(zhì)及CYP450含量進(jìn)行了測(cè)定，并運(yùn)用高效液相色譜法，色譜柱:依利特色譜柱，150 mm×4.6 mm，i.d.5.0μm;流動(dòng)相:乙腈:0.1％三乙胺，體積比為20∶80;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣體積:20μL，來(lái)檢測(cè)豬、羊和小鼠肝臟微粒體對(duì)其代謝表征的不

4、同，我們運(yùn)用探針?lè)疾熵i、羊、小鼠以及經(jīng)過(guò)鉤吻誘導(dǎo)后細(xì)胞色素P450酶活性的異同從而來(lái)初步揭示三者之間的機(jī)制的異同。結(jié)果經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)閩產(chǎn)鉤吻根總堿經(jīng)口服給藥對(duì)小鼠的LD50為4.12 mg/kg，其95％的可信區(qū)間為3.76～4.52 mg/kg。檢測(cè)出所制備的小鼠、豬、羊肝微粒體的蛋白含量為6.973 mg/mL、24.805 mg/mL、28.200 mg/mL，CYP450的含量分別為0.379 nmol/mg、0.798 n

5、mol/mg、0.847 nmol/mg。通過(guò)高效液相色譜法發(fā)現(xiàn)豬羊?qū)︺^吻素子均有代謝而小鼠未有明顯代謝，同時(shí)我們對(duì)豬羊肝微粒體對(duì)鉤吻素子代謝的最優(yōu)條件進(jìn)行了考察，研究發(fā)現(xiàn)鉤吻素子在豬肝微粒體中代謝的最優(yōu)體外反應(yīng)體系條件是:孵育時(shí)間為90 min、肝微粒體蛋白濃度為2.5 mg/mL、鉤吻素子的濃度500μg/mL;鉤吻素子在羊肝微粒體中代謝的最優(yōu)體外反應(yīng)體系條件是:孵育時(shí)間為70 min、肝微粒體蛋白濃度為3.0 mg/mL、鉤吻素子