連翹脂素在肝微粒體中代謝及對大鼠肝CYP3A酶體外抑制作用的研究.pdf

1、連翹為木犀科連翹屬植物連翹Forsythia suspense(Thunb.) Vahl的干燥果實，廣泛分布于中國、韓國、日本以及許多歐洲國家。連翹對于許多疾病都有較好的治療效果，如腎炎，丹毒，淋病，潰瘍等，正因如此，它被視為一種重要的中藥材而廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代研究表明，連翹中富含多種活性化學(xué)成分，主要有木脂素類、黃酮類等。其中，連翹脂素是一種重要的木脂素類成分，在抗氧化、降低血脂、抑制低密度脂蛋白的氧化等方面顯示出一定的藥理活性。

2、　　建立體外肝微粒體孵育體系，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對連翹脂素在肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，同時研究體外大鼠肝微粒連翹脂素代謝的酶動力學(xué)及選擇性CYP450酶抑制劑對其代謝的影響。通過測定大鼠肝微粒體中探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖代謝物（1-羥基咪達(dá)唑侖）的含量，計算連翹臘素的IC50值，從而評價其對CYP3A酶的抑制作用。
　　第一部分連翹脂素在大鼠肝微粒體中的代謝研究
　　目的:建立體外大鼠肝微粒體孵育體系，應(yīng)用LC-MS/MS法，對

3、連翹脂素在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　方法:超速離心法制備大鼠肝微粒體，采用LC-MS/MS法測定孵育液中的代謝物。將溫孵樣品分別在EMS-IDA-EPI、MRM-IDA-EPI模式下進(jìn)行檢測，分析反應(yīng)生成的連翹脂素代謝產(chǎn)物。采用Diamonsil C18色譜柱（2504.6 mm，5μm），流動相為0.1％甲酸水-乙腈，梯度洗脫，流速為800μL·min-1;進(jìn)樣量20μL。采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，電噴霧離子源，源溫

4、度為650℃。
　　結(jié)果:通過與空白樣品比較，檢測到13個Ⅰ相代謝物，未能檢測到葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。同時，對負(fù)離子模式下連翹脂素可能的裂解途徑進(jìn)行了推斷。
　　結(jié)論:所建立的LC-MS/MS測定法應(yīng)用于連翹脂素在大鼠肝微粒體中的代謝，為連翹脂素的藥物代謝動力學(xué)研究提供了依據(jù)。
　　第二部分連翹脂素在人肝微粒體中的代謝研究
　　目的:建立體外人源肝微粒體孵育體系，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS法，對連翹脂素在人肝

5、微粒體中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　方法:采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱（1002.1mm，2.6μm），以0.1％甲酸水-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為400μL·min-1;進(jìn)樣量5μL。采用正離子模式進(jìn)行檢測，電噴霧離子源，源溫度為550℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z100～1000。
　　結(jié)果:對ESI-MS正離子模式下連翹脂素可能的裂解途徑進(jìn)行推測，同時鑒定連翹脂素在肝微粒體中的8個代謝產(chǎn)物。

6、r>　　結(jié)論:所建立的連翹脂素在人肝微粒體中的UHPLC-Q-TOF-MS測定法簡便快速。未能檢測到葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。
　　第三部分連翹脂素在大鼠肝微粒體中的酶促反應(yīng)動力學(xué)及酶表型鑒定
　　目的:研究連翹脂素體外大鼠肝微粒體代謝的酶動力學(xué)，計算其酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，并考察選擇性CYP450酶抑制劑對連翹脂素代謝的影響。
　　方法:分別以溫孵時間、肝微粒體蛋白濃度和底物濃度為考察對象，優(yōu)化溫孵條件，用Lineweave

7、r-Burk作圖法計算連翹脂素在大鼠肝微粒體中的酶動力學(xué)參數(shù)。運(yùn)用CYP450酶選擇性抑制劑研究參與連翹脂素肝微粒體代謝的主要CYP亞型。
　　結(jié)果:連翹脂素在大鼠肝微粒體中最佳溫孵時間為20 min，蛋白濃度為1 mg·mL-1，底物濃度為30μmol·L-1，Km=44.85μmol·L-1，Vmax=0.4286μmol·(min·mg protein)-1?；瘜W(xué)抑制劑試驗表明，奎寧、4-甲基吡唑、鹽酸噻氯匹定能夠明顯抑制連

8、翹脂素的代謝。
　　結(jié)論:CYP2B、CYP2D和CYP2E1是參與連翹脂素代謝的主要代謝酶，CYP1A2、CYP2C和CYP3A沒有明顯參與催化其代謝。
　　第四部分連翹脂素對大鼠肝微粒體CYP3A的抑制作用
　　目的:采用探針底物法研究連翹脂素對大鼠肝微粒體CYP3A的抑制作用。
　　方法:將CYP3A酶的特異性探針底物咪達(dá)唑侖與不同濃度的連翹脂素在大鼠肝微粒體中共溫孵，采用LC-MS/MS法測定探針底物生成

9、的代謝產(chǎn)物1-羥基瞇達(dá)唑侖，計算其IC50值。同時將CYP3A酶的特異性抑制劑酮康唑與探針底物共溫孵，且對方法進(jìn)行考察與驗證。
　　結(jié)果:在大鼠肝微粒體溫孵體系中，連翹脂素對CYP3A的IC50值為92.68 mol·L-1。酮康唑與探針底物共溫孵所得的IC50值與文獻(xiàn)報道的基本一致。
　　結(jié)論:本研究建立的探針底物法可以用于預(yù)測連翹脂素對大鼠肝微粒體中CYP3A酶活性的抑制作用。連翹脂素的IC50表明其對CYP3A沒有抑制