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文檔簡介
1、目的:
1.建立靈敏度高、專屬性強(qiáng)、方便可行的HPLC-QTOF-MS/MS法測定Wistar大鼠生物樣本中的巖白菜素及巖白菜素代謝產(chǎn)物。
2.獲得巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)分子離子峰,二級碎片離子,推測其二級碎片裂解方式。
3.測定灌胃給予巖白菜素混懸液后大鼠生物樣本中的代謝產(chǎn)物。
4.根據(jù)測得的巖白菜素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推測巖白菜素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。
5.確定巖白菜素在混合HLMs孵育體系中的
2、最佳混合HLMs濃度和最佳孵育時(shí)間。
6.建立靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便可行的HPLC-MS/MS法、HPLC法測定巖白菜素的葡糖醛酸化代謝產(chǎn)物。
7.研究β-D-葡萄糖醛酸苷酶對葡糖醛酸化巖白菜素的水解作用。
8.考察巖白菜素在UGT重組酶孵育體系中的葡糖醛酸化反應(yīng)。
9.測定巖白菜素葡糖醛酸化的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
10.考察13個(gè)個(gè)體的HLMs中巖白菜素和膽紅素葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性的相關(guān)性分
3、析。11.考察UGT1A1重組酶抑制劑保泰松、底物雌二醇和膽紅素對巖白菜素葡糖醛酸化反應(yīng)的抑制作用。
方法:
1.Agilent6538 HPLC-QTOF-MS/MS儀器進(jìn)行樣本分析,流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為乙腈,流動(dòng)相比例為5%-95%B(0-20 min),95%B(20-22 min),95%-5%(22-25 min),流速:0.8 mL/min,進(jìn)樣量10μL,每個(gè)樣本進(jìn)樣完成后平衡10 min。
4、 2.配制500 ng/mL巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-QTOF-MS/MS全掃描和子離子掃描(MS2)分析。
3.分別采集灌胃給藥前和給藥后Wistar大鼠生物樣本,對樣本沉淀蛋白處理后,進(jìn)樣HPLC-QTOF-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行全掃描分析,對比給藥前與給藥后生物樣本總離子色譜圖提取的準(zhǔn)分子離子,對可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行二級碎片掃描(MS2)分析,根據(jù)特征性二級碎片確定巖白菜素代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)巖白菜素及代
5、謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推測巖白菜素在Wistar大鼠體內(nèi)代謝途徑。
5.巖白菜素分別在0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL混合HLMs孵育體系中孵育30 min后終止反應(yīng)考察混合HLMs最佳孵育濃度。0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系分別在孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80 min后終止反應(yīng),考察孵育體系的最佳孵育時(shí)間。
6.巖白菜素分別與含有UDPGA的有活性或高溫滅活后的混合HLM
6、s孵育體系進(jìn)行孵育,采用HPLC-MS/MS方法對巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。Diamonsil C18色譜柱(150×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇∶0.1%甲酸水=30∶70(V/V),在線脫氣;流速0.4 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL,ESI離子源,分別采用正、負(fù)離子模式對樣本進(jìn)行分析,采用全掃描(scan)、選擇離子檢測(SIM)及子離子掃描(Product Ion Scanning)模式對樣本進(jìn)行分
7、析。采用HPLC-UV方法對巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定量分析,Diamonsil C18色譜柱(150×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇∶0.1%甲酸水=15∶85(V/V);流速1 mL/min;柱溫室溫;監(jiān)測波長272 nm;進(jìn)樣量20μL。
7.多個(gè)巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液樣本在混合HLMs孵育體系中孵育30 min加入終止液終止反應(yīng),收集、混合所有樣本的上清液,并分為兩組實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組重復(fù)3個(gè)樣本,所有樣本40℃
8、水浴N2吹干后,實(shí)驗(yàn)組采用500μL含2000單位β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05M醋酸鈉緩沖液復(fù)溶,對照組采用500μL不含β-D-葡萄糖醛酸苷酶的0.05 M醋酸鈉緩沖液復(fù)溶。復(fù)溶樣本37℃水浴中孵育4h后取出100μL用終止液中終止反應(yīng), HPLC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)樣分析。
8.采用50,250,500μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與滅活的或未滅活的不同UGT重組酶進(jìn)行孵育。
9.巖白菜素系列濃度分別在混合HLMs和
9、UGT1A1重組酶進(jìn)行孵育,測定葡糖醛酸化巖白菜素的濃度,擬合酶動(dòng)力學(xué)曲線,并根據(jù)米氏公式計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)。
10.250μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和100μM膽紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與13個(gè)不同個(gè)體的HLM進(jìn)行孵育,分別測定葡糖醛酸化巖白菜素和葡糖醛酸化膽紅素的濃度,計(jì)算其代謝速率。由葡糖醛酸化巖白菜素代謝速率對葡糖醛酸化膽紅素代謝速率做直線分析,所得相關(guān)系數(shù)(r)評價(jià)兩藥相關(guān)性,P<0.
10、05認(rèn)為有顯著性差異。
11.250μM巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與有活性混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系進(jìn)行孵育作為陽性對照組,與高溫滅活的混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系進(jìn)行孵育作為陰性對照組,實(shí)驗(yàn)組分別采用250μM巖白菜素與10-500μM保泰松、雌二醇、膽紅素與有活性混合HLMs或UGT1A1重組酶孵育體系共同孵育。采用HPLC法分別測定陰性對照組,陽性對照組及各實(shí)驗(yàn)組的素葡糖醛酸化巖白菜的濃度,分別計(jì)算保
11、泰松、雌二醇、膽紅素對巖白菜素的IC50。
結(jié)果:
1.HPLC-QTOF-MS/MS法測定Wistar大鼠生物樣本中的巖白菜素及巖白菜素代謝產(chǎn)物靈敏度高、專屬性強(qiáng)、方便可行。
2.進(jìn)樣分析巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液,巖白菜素的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z327.0718。m/z327.0718的主要二級碎片離子為m/z312.0491,249.0407,234.0169,207.0295,192.0061。
12、> 3.對灌胃給藥前后的大鼠生物樣本總離子流色譜圖進(jìn)行提取離子分析,對比給藥前和給藥后生物樣本中的準(zhǔn)分子離子,找出了幾種可能的代謝產(chǎn)物,并根據(jù)其MS2信息進(jìn)一步推測代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示在膽汁、尿液及糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了巖白菜素(M0)(m/z327.07)及其代謝產(chǎn)物M1和M1'(m/z503.11),M2和M2'(m/z407.03)和M3(m/z359.10),在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了巖白菜素(M0)(m/z327.07)及其一種代謝產(chǎn)
13、物M3(m/z359.10)。
4.根據(jù)巖白菜素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)推斷巖白菜素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑為葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三種途徑。
5.巖白菜素在不同濃度(0.25、0.5、0.8、1.0、1.25 mg/mL)混合HLMs孵育體系中孵育30min后,結(jié)果顯示0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系中巖白菜素的代謝率在25%左右;巖白菜素在0.8 mg/mL混合HLMs孵育體系中分別孵育0、10、20、30、4
14、0、50、60、70、80 min后終止反應(yīng),結(jié)果顯示孵育30 min時(shí)巖白菜素濃度的代謝率在25%左右,最終確定巖白菜素孵育體系的混合HLMs最佳孵育濃度為0.8 mg/mL,最佳孵育時(shí)間為30min。
6.巖白菜素分別與含有UGDPA的有活性或高溫滅活后混合HLMs孵育系統(tǒng)孵育后,HPLC-MS/MS法對樣本進(jìn)行定性分析,對比兩組樣本的質(zhì)譜圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)有活性的混合HLMs孵育組有準(zhǔn)分子離子峰m/z503.1([M-H]-),
15、與巖白菜素的準(zhǔn)分子離子峰m/z327.1相差176 Da,且其二級碎片中含有葡糖醛酸基團(tuán)的特征性碎片m/z175和112.9,最終確定該代謝產(chǎn)物為葡糖醛酸化巖白菜素。HPLC法對葡糖醛酸化巖白菜素的定量分析重現(xiàn)性好、精密度高,穩(wěn)定性好,與雜質(zhì)分離完全,適用于酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定。
7.經(jīng)β-D-葡萄糖醛酸苷酶水解的代謝樣本中,葡糖醛酸化巖白菜素消失,巖白菜素原形藥的增加與減少的葡糖醛酸化巖白菜素一致,未添加β-葡萄糖醛酸苷酶的對
16、照組中葡糖醛酸化巖白菜素及巖白菜素原形藥未見變化。
8.50、250、500μM的巖白菜素分別與不同的UGT重組酶(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B4、2B7、2B15、2B17)孵育后,結(jié)果顯示只有UGT1A1重組酶中發(fā)生了代謝,產(chǎn)生巖白菜素葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。
9.5μM-1 mM巖白菜素經(jīng)混合HLMs及UGT1A1重組酶孵育體系孵育后所得葡糖醛酸化巖白菜素的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
17、Km值、Vmax、 CLint(Vmax/Km)結(jié)果分別為231.62±14.08和200.37±26.73μM,2.17±0.21和1.88±0.26 nmol/min/(mgprotein),9.39和9.38μL/min/(mg protein)。
10.巖白菜素葡糖醛酸活性與重組人UGT1A1探針底物膽紅素葡糖醛酸活性具有顯著相關(guān)性(R2=0.9629,P<0.01)。
11.在混合HLMs和UGT1A1重組
18、酶孵育體系中UGT1A1重組酶的抑制劑保泰松,底物雌二醇和膽紅素對250μM巖白菜素的IC50分別為92.89±6.3和77.3±7.3,112.98±12.4和97.27±15.6,68.55±8.2和59.57±11.7μM。
結(jié)論:
1.本研究利用HPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)分析灌胃給藥巖白菜素前和給藥后大鼠的膽汁、血漿、尿液和糞便樣本,分析可能的代謝產(chǎn)物,利用二級碎片推測其結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠膽汁、血
19、漿、尿液、糞便樣本中共存在巖白菜素3種可能的代謝產(chǎn)物(M1和M1' m/z503.11,M2和M2' m/z407.03,M3 m/z359.10),分別為葡糖醛酸化、硫酸化、水解合并甲基化三種代謝途徑。
2.巖白菜素的體外代謝研究發(fā)現(xiàn),在UDPGA存在的混合HLMs孵育體系中巖白菜素發(fā)生葡糖醛酸化反應(yīng),UGT1A1重組酶為巖白菜素葡糖醛酸化的主要代謝酶。UGT1A1重組酶的抑制劑保泰松,底物雌二醇和膽紅素均對混合HLMs和U
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