巖白菜素的人體與動物藥代動力學及對IGABA的作用研究.pdf

1、目的：
　　 創(chuàng)建靈敏度高、特異性強的，適合巖白菜素體內藥代動力學研究的液相色譜-二級質譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)生物樣本濃度測定方法。
　　 建立靈敏度高、專屬性強、方便可行的高效液相色譜法(HPLC)并且首次測定昆明種(KM)小鼠血漿及組織中巖白菜素濃度，評價巖白菜素在健康小鼠體內的吸收、分布、代謝、排泄過程。
　　 采用建立的HPLC-MS/MS血藥測定方法首次進行口服巖白菜素后人體藥代動力學研究。進行

2、中國健康志愿者單次單劑量口服巖白菜素(250mg)的藥代動力學研究，了解其人體吸收、分布、消除體內過程規(guī)律。為制定科學合理的巖白菜素臨床給藥方案和深入的藥效機制研究提供依據(jù)。
　　 建立高靈敏度和精確度、專屬性強的液相色譜-一級質譜聯(lián)用(HPLC-MS)血藥濃度測定方法。并對健康志愿者單次單劑量口服復方巖白菜素片(巖白菜素與馬來酸氯苯那敏)中小劑量聯(lián)用的氯苯那敏(4mg)進行人體藥代動力學規(guī)律研究。
　　 應用膜片鉗技術

3、記錄巖白菜素對大鼠海馬中樞神經元和GABAA受體轉染的HEK293細胞膜上γ-氨基丁酸(GABA)-激活電流(IGABA)的調制作用，同時對比巖白菜素對谷氨酸(Glu)-激活電流(IGLU)的影響，分析研究巖白菜素的中樞鎮(zhèn)咳作用的可能分子作用靶點和機制。
　　 應用膜片鉗記錄分析巖白菜素對GABAA受體介導的IGABA的量效關系及電壓-電流(I-V)曲線，分析其作用特點和規(guī)律。
　　 試采用液相色譜和質譜法及膜片鉗等技術

4、多方面分析研究巖白菜素的藥代動力學規(guī)律和藥效學主要作用機制，為新藥開發(fā)和中藥有效化合物研究提供較新的系統(tǒng)思路。
　　 方法：
　　 巖白菜素(1)色譜條件：采用Agilent SB-C18(50mm×2.1mm，3.5μm)色譜柱；流動相為乙腈：水(10:90，V/V)，在線脫氣；流速0.2ml·min-1；柱溫20℃；檢測波長250nm；進樣量20μl。(2)質譜條件：ESI離子源，負離子模式，霧化壓力40 psi，干

5、燥氣(N2)流速9 L·min-1，干燥氣溫度為350℃，毛細管電壓4000V，多級反應監(jiān)測(MRM)方式，m/z：327.1→192(巖白菜素)，m/z：354→185.1(內標)，碰撞能量15V(巖白菜素)和30V(內標)，碎片電壓為100V。
　　 氯苯那敏(1)色譜條件：Venusil XBP-C18(5μm，ID4.6×150mm)色譜柱；流動相為甲醇：0.005M醋酸銨溶液(60:40，V/V)，0.40μm微孔濾膜

6、過濾，在線脫氣；流速0.8ml·min-1；柱溫25℃；進樣量10μl。(2)質譜條件：API-ES離子源，正離子模式，噴霧氣(N2)壓力50psig，干燥氣(N2)流速13.OL·min-1，干燥氣溫度350℃，毛細管電壓4000V，選擇性監(jiān)測質荷比(m/z)為275.1(氯苯那敏)和256.1(苯海拉明)的分子離子峰，碎片電壓分別為90V和70V。
　　 樣本處理：(1)巖白菜素取血漿樣品0.5ml，加入400ng·mL-1

7、甲砜霉素內標溶液20μL，渦旋混勻，加4ml提取液(乙酸乙酯)，渦旋混合1min，5000 r·min-1離心5min，取上層萃取液3.5ml，于40℃水浴N2吹干，殘渣用100μl流動相溶解，進樣20μL。(2)氯苯那敏取血漿0.5ml，加入200ng·mL-1的苯海拉明內標溶液50μl，混勻，加入5ml氯仿，渦旋混勻2min，4000rpm離心5min，吸取下層有機相4ml，40℃水浴N2吹干，殘渣用100μl流動相復溶。
　

8、　 20名健康志愿者，于試驗前一天晚禁食，試驗當日晨抽取空白血樣后，立即空腹口服復方巖白菜素試驗制劑(250mg巖白菜素+4mg氯苯那敏)。不同時間取血，采用HPLC-MS/MS法和HPLC-MS法檢測血漿中巖白菜素原型和氯苯那敏的濃度變化，采用DAS2.0實用藥代動力學程序計算其藥代動力學參數(shù)，分析其藥代動力學特點。同期觀察不良反應。
　　 昆明種小鼠104只，巖白菜素尾靜脈注射給藥3mg·kg-1后靜脈取血及解剖取小鼠的心

9、、肝、脾、腎、小腸、肺、腦，HPLC法測定其濃度或組織含量變化，評價小鼠體內的藥代動力學及組織分布特征參數(shù)。
　　 應用全細胞式膜片鉗技術和外膜外向式單通道技術，記錄巖白菜素對大鼠海馬中樞神經元和GABAA受體轉染的HEK293細胞膜上ICABA的調制作用，并記錄其劑量-效應變化和I-V曲線，分析作用特點。同時采用全細胞模式記錄觀察巖白菜素對IGLU的影響。分析巖白菜素的中樞鎮(zhèn)咳作用的可能機制。
　　 結果：
　　

10、 本實驗創(chuàng)建的巖白菜素體內測定HPLC-MS/MS方法靈敏度高，專屬性強，方便可行。巖白菜素在0.25～60ng·ml-1范圍內線性關系良好，最低定量限可達0.25ng·mL-1，成功測定出巖白菜素主要人體藥代動力學參數(shù)：t1/2為2.850±1.823h，Tmax為1.725±0.638h，AUC0～12為49.013±14.613ng·ml-1·h，Cmax為15.216±5.023ng·ml-1，AUC0～∞為51.352±15

11、.194 ng·ml-1·h。
　　 HPLC-MS方法測定氯苯那敏的定量下限可達0.2ng·ml-1，氯苯那敏在0.2～20ng·ml-1范圍內線性關系良好。聯(lián)用的小劑量氯苯那敏在口服復方巖白菜素片后人體內主要藥代動力學參數(shù)：血藥濃度達峰值Tmax為2.650±0.763h，t1/2為11.480±3.605h，AUC0～36為98.636±22.863ng·ml-1·h，AUC0～∞為113.173±32.390ng·ml-

12、1·h，Cmax為6.636±1.533ng·ml-1。
　　 小鼠靜脈注射巖白菜素后體內藥代動力學參數(shù)：t1/2為1.16±0.03 h，Cmax為2443.3±557.6 mg·L-1，AUC0-8為2482.6±281.4 mg·ml-1·h，AUC0-∞為2482.9±331.0mg·ml-1·h，Vd為1.07±0.08 L·kg-1。巖白菜素經靜脈給藥后，很快分布于全身，在體內組織分布廣泛，代謝快。在動物體內主要分布

13、于血液、肝臟和腎臟組織，其他組織中含量較少，但腦中含量相對肺組織較高。
　　 大鼠海馬中樞神經元和轉染GABAA受體的HEK細胞對外加GABA敏感。神經元上此GABA激活電流可被特異性GABAA受體的選擇性拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline)所完全阻斷。巖白菜素可明顯增強GABA誘導的突觸后抑制性電流IOABA。0.02-10mmoL·L-1巖白菜素對IGABA增強有濃度依賴性變化，量效曲線呈“s”型且EC50為0.81m

14、mol·L-1。加入巖白菜素后GABA量效曲線可明顯上移，但IGABA的最大值在加入巖白菜素前后基本不變。單通道記錄發(fā)現(xiàn)巖白菜素對GABAA受體的影響主要是受體門控性通道的開放概率增加。此外，海馬神經元同時給予50umol·L-1 Glu和1mmol·L-1巖白菜素，IGlu在加入巖白菜素前后無明顯改變(P>0.05)。
　　 結論：
　　 創(chuàng)建報道的巖白菜素體內測定HPLC-MS/MS方法靈敏度高，專屬性強，方便可行。

15、巖白菜素在0.25～60ng·ml-1范圍內線性關系良好，最低定量限可達0.25ng·mL-1。健康志愿者口服巖白菜素250mg后達峰時間短，吸收迅速，半衰期不長顯示人體內消除速度較快。藥代動力學特點符合二室模型。
　　 建立的HPLC-MS方法測定氯苯那敏定量下限可達0.2ng·mL-1，氯苯那敏在0.2～20ng·ml-1范圍內線性關系良好。可很好的檢測復方給藥后血藥濃度很低的氯苯那敏。也可用于單方及其它劑型的檢測?？诜撍?/p>

16、后吸收較快且完全，比巖白菜素半衰期長可在體內停留較長時間。
　　 小鼠靜脈給藥后巖白菜素的半衰期短，分布廣泛，其中肝臟腎臟分布高，說明巖白菜素消除代謝快，發(fā)現(xiàn)腦組織相對肺組織含量高，可能與中樞性鎮(zhèn)咳有關。
　　 巖白菜素能夠增強突觸后抑制性電流IGABA；且?guī)r白菜素自身無法激活IGABA，與GABA合用可使GABAA受體開放的概率增加，從而增強IGABA。說明巖白菜素可能提高GABA和GABAA受體的親和力來增強IGAB

17、A。巖白菜素對IGLU無影響。提示巖白菜素中樞鎮(zhèn)咳作用的分子作用機制可能與GABA密切相關。
　　 巖白菜素和氯苯那敏安全性高，實驗期間未見不良反應發(fā)生。
　　 啟示：
　　 液相色譜-質譜法和膜片鉗技術綜合應用聯(lián)合運用現(xiàn)代先進檢測技術，對新藥或中藥有效化合物的藥代動力學和藥效學機制綜合評價有重要意義。
　　 巖白菜素的鎮(zhèn)咳及相關作用機制研究進一步研究巖白菜素對GABA等各類受體的作用和體內外實驗效應，可