miR-124介導ICAM-1對MCP-1的調節(jié)作用和對巨噬細胞極化的影響.pdf

1、動物肺組織受到細菌和病毒感染時，機體內的免疫細胞會發(fā)生應急反應，以抵抗感染。但該應急反應過多，會引起肺組織損傷，導致肺部炎癥和急性肺損傷(ALI)，甚至會導致急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。免疫細胞在肺部的募集是一個有序的過程，中性粒細胞是第一波反應的免疫細胞，感染后1～2小時在肺部募集。募集后的中性粒細胞，跨內皮細胞層遷移進入肺泡，釋放可對抗入侵細菌和病毒的物質。單核細胞則是在感染24～48小時后第二波在肺部募集的免疫細胞，進入肺組織

2、后的單核細胞可分化為巨噬細胞和樹突細胞。巨噬細胞可通過極化發(fā)揮促炎或抗炎作用，但目前在肺損傷中這種作用還不明確。
　　ICAM-1作為細胞的黏附分子，在中性粒細胞募集時表達迅速增加，介導中性粒細胞黏附在毛細血管壁上，穿越血管內皮層而浸潤到肺組織中。浸潤的中性粒細胞及受影響的內皮細胞和巨噬細胞，分泌單核細胞趨化因子MCP-1進一步誘導單核細胞在肺組織的募集。miRNA(microRNA)是小RNA的一種，通過靶向mRNA降解或抑制蛋

3、白的翻譯，在多種生物學過程中發(fā)揮關鍵作用。有研究表明，肺組織中miRNA可以影響MCP-1的表達，而ICAM-1是否能通過miRNA影響MCP-1的表達，目前還不是很清楚。本研究選取小鼠單核巨噬細胞作為研究對象，試圖探討ICAM-1在肺組織中是否通過miRNA調節(jié)趨化因子MCP-1的表達，及其對巨噬細胞極化的影響。研究內容如下:
　　1.ICAM-1敲除對MCP-1和miR-124表達的影響
　　首先我們在ICAM-1敲除小

4、鼠的肺組織中，發(fā)現(xiàn)MCP-1的蛋白表達量增加。選擇小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)轉染ICAM-1的siRNA，細胞中ICAM-1的表達被抑制后，提高了MCP-1的蛋白表達。ICAM-1敲除的小鼠肺組織，經小RNA測序后，發(fā)現(xiàn)miR-124的表達顯著降低，RT-PCR進一步驗證了測序結果。
　　2.miRNA-124靶基因的驗證
　　經生物信息學軟件預測miR-124在小鼠肺組織的靶點，發(fā)現(xiàn)miR-124能與MCP-1的

5、3'UTR序列互補結合，MCP-1是miR-124潛在的靶基因。構建包含MCP-13'UTR的野生型、突變型和缺失型雙熒光素酶質粒，經熒光素酶活性分析，表明 MCP-1是miR-124的靶基因。miR-124模擬物或抑制劑轉染小鼠單核巨噬細胞，RT-PCR和Western blot檢測MCP-1的表達，發(fā)現(xiàn)miR-124能抑制MCP-1的轉錄與翻譯。
　　3.轉錄因子SP-1對miR-124的轉錄調控
　　為了研究miR-1

6、24表達的分子機制，克隆小鼠miR-124的啟動子序列，構建于PGL3-Basic載體中，在小鼠單核巨噬細胞中驗證其啟動子的活性，通過熒光活性分析證實啟動子pre-493區(qū)域內含有激活miR-124轉錄的轉錄因子。生物信息學分析結合位點，預測SP-1與miR-124可能結合的位點。經轉錄位點突變和凝膠遷移實驗，確定了SP-1對miR-124的關鍵作用位點和兩者的相互結合。
　　4.miR-124、ICAM-1調控巨噬細胞極化

7、>　　LPS(2μg/mL)和IL-4（20ng/mL）分別處理小鼠單核巨噬細胞，構建極化模型。我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導細胞分化為M1型，IL-4誘導細胞分化為M2型。將miR-124的模擬物和ICAM-1 siRNA分別轉染單核巨噬細胞，檢測M1/M2型巨噬細胞的標志分子。我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和miR-124具有促進M2型極化的作用，促進標志分子ym-1、Mrc-1和IL-10的表達。表明miR-124和ICAM-1具有抗炎作用，能抑制小鼠

8、單核細胞中的炎性反應。
　　5.miR-124對動物體內肺損傷的作用
　　本研究通過LPS(10mg/kg)誘導體內肺損傷的炎癥模型，確認miR-124對肺損傷的作用。將miR-124(2OD)尾靜脈注射小鼠，RT-PCR檢測miR-124在肺組織中的表達增加。然后用LPS誘導小鼠肺損傷，檢測肺髓過氧化物酶活性(MPO)，與單獨LPS誘導的小鼠相比，miR-124抑制了MPO的活性，對肺損傷起到了保護的作用。
　　PR

9、RSV感染的豬肺組織中，我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和miR-124的表達上調，MCP-1的表達下調。表明在PRRSV造成的豬肺損傷組織中，ICAM-1、miR-124與MCP-1的表達負相關，積極參與豬肺組織中的炎癥反應。
　　綜上所述，本研究通過對比野生型小鼠和ICAM-1敲除小鼠中MCP-1的表達，經miRNA測序，差異表達分析發(fā)現(xiàn)潛在調控MCP-1的miRNA，闡明ICAM-1能通過miR-124調節(jié)趨化因子MCP-1的蛋白表達來