TLR4對大鼠腦出血后炎癥反應和神經細胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的： 腦出血是神經系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其致殘率和死亡率均很高，嚴重影響人類的健康和患者的生存質量。近年來，炎癥反應在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用越來越受到重視，并認為它可能導致了腦出血后的細胞凋亡過程。目前腦出血后炎癥發(fā)生機制目前仍不十分清楚，其產生炎癥反應的始動環(huán)節(jié)尚不明確。TLRs是一個新發(fā)現(xiàn)的有高度保守序列而古老的天然免疫受體家族。TLR4作為膜受體“門戶”蛋白能夠識別生物源性和非生物源性刺激，然后將信號傳遞給核轉錄因子N

2、F-кB，啟動和放大炎癥反應，導致多種炎癥因子的瀑布式釋放，產生損傷效應。本研究利用立體定向技術向大鼠尾狀核內注入50μL自體股動脈血建立腦出血模型，用TUNEL染色觀察神經細胞凋亡，用免疫組化法檢測腦出血后的血腫周圍腦組織TLR4、NF-кB/p65和caspase-3的表達動態(tài)變化，用RT-PCR法檢測血腫周圍腦組織TLR4mRNA表達，旨在研究TLR4mRNA及蛋白是否在腦出血后血腫周圍腦組織表達及分布，從而探討TLR4信號通路在

3、腦出血后繼發(fā)損傷(主要指凋亡)中的作用研究。 材料與方法 一、材料 1、動物分組 選擇健康雄性Wister大鼠90只，體重250-300g，隨機分成個生理鹽水對照組、腦出血實驗組，分別按6h、1d、3d、7d分為4個亞組，每個亞組n=10；1個正常對照組，n=10。 2、主要儀器 動物頭顱立體定位儀、電子分析天平、圖像分析儀、紫外分光光度儀、PCR擴增儀、低溫離心機、凝膠成像分析系統(tǒng)。

4、 3、主要試劑 TLR4兔抗鼠多克隆抗體、NF-кBp65兔抗鼠多克隆抗、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、二部法免疫組化檢測試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒、Trizol、RNAPCRKit(AMV)、TLR4、引物、DNAMaker、DEPC、氯仿、異丙醇4、大鼠腦出血模型制作用微量注射器抽取70uL大鼠自體股動脈血。立即將大鼠俯臥位于腦立體定位儀上，于前囟前0.2mm，中線右旁3.0mm，進針約6m

5、m(大鼠尾狀核處)，將大鼠自體股動脈血50uL緩慢推注入腦。生理鹽水對照組注入50uL生理鹽水。正常對照組不予任何處置。 5、標本制作 取各組5只大鼠于術后相應時間點麻醉開胸，迅速暴露心臟，4％多聚甲醛灌注固定，取腦，樣本置于4％多聚甲醛外固定4小時，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5um，進行切片HE染色和免疫組化染色。取各組5只大鼠于術后相應時間點麻醉，斷頭取腦，置于Trizol中，-80℃冰箱保

6、存，待進行RT-PCR檢測。 二、檢測指標 1、TUNEL陽性細胞檢測切片滴加脫氧核糖核酸轉移酶(TDT)和地高辛標記的dUTP反應液，37℃孵育120min；滴加生物素化抗地高辛抗體，37℃孵育30min，各步驟用0.01MTBS(pH7.5)洗滌3min×3次；DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細胞積分光密度。 2、TLR4蛋白表達免疫組化檢測二步法進行TLR4蛋白表

7、達陽性細胞測定。切片滴加50uL兔抗鼠多克隆TLR4抗體(1:150)，4℃過夜，PBS洗3min×3次；滴加一滴山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，各步驟用PBS洗3min×3次，DAB顯色劑，蘇木素輕度復染，脫水透明，封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細胞積分光密度。 3、NF-кB/p65蛋白、Caspase-3蛋白表達免疫組化檢測SABC法進行NF-кB/p65蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞測定。切片滴加5

8、0uL一抗工作液(兔抗鼠多克隆NF-кB/p65抗體(1:400)、兔抗鼠多克隆Caspase-3抗體(1:150))，4℃過夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG，37℃20min；滴加SABC，37℃20min，各步驟用PBS洗3min×3次；DAB顯色劑，木素輕度復染，脫水透明，封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細胞積分光密度。 4、TLR4mRNA表達RT-PCR方法檢測取腦出血血腫周圍腦組織100mg，按Trizol法

9、RNA提取試劑盒說明，在無RNA酶的環(huán)境下提取總RNA后，進行反轉錄反應和PCR擴增反應，取擴增產物進行電泳，泳結果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析，計算TLR4mRNA與βactinmRNA光密度積分比值。 三、統(tǒng)計分析 所有數(shù)據以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS17.0及Excel統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，在單因素方差分析有意義的基礎上再進行組間兩兩比較，兩變量之間相關關系行

10、peasron相關分析，p<0.05為差異顯著。 結果： 1、腦出血后細胞凋亡的動態(tài)變化TUNEL染色陽性細胞在腦出血后6h出現(xiàn)，1d凋亡細胞數(shù)明顯增多，3d達到高峰，7d后逐漸減少，但是與對照組相比仍有顯著差異(p<0.05)。凋亡細胞數(shù)主要在血腫周圍和同側大腦皮層。腦出血后3d出現(xiàn)一些典型凋亡細胞，如新月形、馬蹄形和由核碎片聚集的凋亡小體。凋亡細胞大部分是神經元細胞。 2、腦出血后caspase-3蛋白表達腦

11、出血后6h在血腫周圍和同側大腦皮層有caspase-3弱陽性表達，陽性部位主要為胞漿。1d后出現(xiàn)大量陽性反應神經元。腦出血后3d達高峰，著色最深，呈棕褐色，并出現(xiàn)核陽性著色，說明caspase-3裂解后有核轉移。7d后數(shù)量減少，但積分光密度較對照組仍有顯著差異(P<0.05)。 3、腦出血后NF-кBp65表達腦出血后血腫周圍NF-кBp65陽性細胞于術后6h開始增多，1d其表達繼續(xù)上升，3d達高峰，此后NF-кBp65表達開始

12、下降，持續(xù)到7d仍高于對照組(p<0.05)。其表達以膠質細胞為主，也有部分神經元細胞，陽性表達為胞核黃褐色，蘇木素不能復染。血腫對側也有少量NF-кBp65表達。生理鹽水對照組僅有極少量陽性細胞。 4、腦組織TLR4蛋白表達腦出血組出血腫周圍和同側大腦皮層有TLR4表達均高于對照組，6h開始升高，3d達高峰，其分布更為普及和均一化，之后表達強度緩慢下降，7天后表達與對照組相比仍有顯著差異(p<0.05)。 5、腦組織T

13、LR4mRNA表達結果顯示正常大鼠腦組織有TLR4mRNA表達，生理鹽水對照組TLR4mRNA表達升高，與正常對照組及組間比較無顯著差異；腦出血組TLR4mRNA表達均高于對照組，6h開始升高，3d達高峰，7d后逐漸減低，但與對照組仍有顯著差異(p<0.05)。 討論 在本實驗中采用向大鼠右側尾狀核內注射自體股動脈血制作腦出血模型，通過rt-PCR和免疫組化法對TLR4進行檢測，發(fā)現(xiàn)出血后的大鼠腦組織中TLR4mRNA和

14、蛋白均動態(tài)表達。近年來，許多實驗研究都證實，細胞凋亡機制參與了腦出血后繼發(fā)性損傷。在本實驗中應用相鄰切片分別進行Caspase-3免疫組化和TUNEL染色，兩者陽性細胞范圍及時間變化基本一致。提示Caspase-3在腦出血后神經細胞凋亡中起重要調控作用。NF-кB信號通路是TLR4胞內信號轉導通路中最重要的下游通路，參與炎癥反應和細胞凋亡等重要的病理生理過程。本實驗發(fā)現(xiàn)，TL4表達與NF-кB表達量及核陽性率的升高呈正相關，且與炎癥細胞

15、浸潤高峰也一致，這表明TLR4表達的增多伴有神經細胞內NF-кB的激活，即NF-кB的核移位，但是這并不能從本質上說明TLR4激活了NF-кB，只能說TL4參與了腦出血后大鼠腦內的炎癥反應。但已有大量實驗證明TLR4信號途徑主要集中激活NF-кB，啟動和放大炎癥反應，導致多種炎癥因子的瀑布式釋放，產生損傷效應。大量文獻也證實了腦出血后血腫周圍存在上述炎癥反應，并認為它可能導致了腦出血后的細胞凋亡過程。大鼠腦出血后炎癥細胞浸潤時間與細胞凋