心肌細胞TLR4促進心梗后心臟炎癥反應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的一個重要病理特征是系統(tǒng)炎癥反應(yīng)（systemic inflammation），表現(xiàn)為循環(huán)血中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素（interleukin，IL）等炎性因子持續(xù)增多。這種炎癥反應(yīng)的來源廣泛，包括心臟自身，也包括肝、肺、血管內(nèi)皮、循環(huán)血中的白細胞等。就心臟而言，其中任何類型的細胞均可能作為炎癥反應(yīng)的來源

2、。有研究表明，浸潤心肌的白細胞以及心臟自身的成纖維細胞是心臟炎癥反應(yīng)的來源，而心肌細胞在CHF炎癥反應(yīng)中的作用及機制尚不明確。文獻資料以及我們課題組的前期工作表明，心肌細胞可表達特定類型的免疫受體，例如toll樣受體（toll-like receptors，TLR），這些免疫受體具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的特性，如果被激活，則很可能使心肌細胞成為“炎性細胞”。有資料表明，心衰心臟中TLR4表達升高，但是沒有明確心肌細胞TLR4表達是否升高；再者，

3、CHF心肌細胞TLR4的功能狀態(tài)如何尚未見研究，其是否具有不同于正常心肌細胞 TLR4的致炎效應(yīng)仍屬未知。為了揭示CHF心臟中的心肌細胞是否扮演“炎性細胞”角色，并探討該“炎性”角色是否源于其中TLR4的表達量和致炎效應(yīng)增強，本課題利用大鼠心肌梗塞所致CHF模型，研究TLR4在心梗后CHF心肌細胞中的表達水平、與配體的結(jié)合能力以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力，以明確心肌細胞TLR4是否促進CHF心臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　方法：
　　雄

4、性成年 SD大鼠45只，全麻下開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支，造成心肌梗塞（myocardial infarction，MI）；假手術(shù)動物經(jīng)受相同手術(shù)過程，但不作結(jié)扎。心梗后4周，行心臟超聲檢測，確認心功能障礙，即表明CHF。
　　將心梗后CHF大鼠過量麻醉致死，進行以下檢測：
　?。?）取血清，ELISA法測定BNP。
　?。?）取缺血區(qū)和遠端區(qū)心肌，分別用real-time RT-PCR和Western blot法測定心

5、肌組織TLR4 mRNA和蛋白含量。
　?。?）用多聚甲醛固定心臟，按常規(guī)行石蠟包埋和切片，用免疫組化法檢測心肌細胞TLR4的分布和表達水平。
　?。?）取心臟，用Langendorff裝置經(jīng)主動脈逆行灌流II型膠原酶，消化分離并收集心肌細胞。用real-time RT-PCR法測定心肌細胞 TLR4以及炎癥因子 IL-6和TNF-α的 mRNA含量，用Western blot法測定蛋白含量；用ELISA法測定炎癥因子 IL

6、-6和TNF-α的蛋白含量；用免疫熒光細胞化學(xué)法檢測心肌細胞 TLR4的分布和含量；用帶有熒光分子標(biāo)記的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）配體LPS（lipopolysaccharide）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）配體HSP60（heat shock protein60kD）分別與心肌細胞共

7、孵育，以結(jié)合并激活心肌細胞內(nèi)的TLR4，通過結(jié)合的熒光強度分析心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體的親和力，并通過炎癥因子表達和釋放量分析心肌細胞TLR4的致炎效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.心梗后CHF大鼠模型的建立
　　在心梗后4w，心超測得CHF組左心室舒張末和收縮末內(nèi)徑均顯著大于假手術(shù)組，左心室縮短分?jǐn)?shù)均低于20％（平均15.6±4.2%），且左心室前壁運動明顯減弱、部分動物左心室后壁運動也減弱；血清BNP檢測

8、顯示CHF組BNP顯著高于假手術(shù)組；心肌切片HE染色顯示CHF心腔明顯擴大，缺血梗死區(qū)見大量炎性細胞浸潤。上述結(jié)果表明心梗后4w動物發(fā)生了CHF。
　　2.心梗后CHF大鼠發(fā)生了心臟炎癥反應(yīng)及全身炎癥反應(yīng)
　　在心梗后CHF大鼠心臟，缺血梗死區(qū)及遠端區(qū)炎癥因子TNFa和IL-6的mRNA和蛋白表達量均顯著升高；CHF組血清TNFa和IL-6蛋白含量顯著高于假手術(shù)組；在急性消化分離的心肌細胞，CHF組心肌細胞TNFa和IL-6

9、的mRNA和蛋白表達量均顯著高于假手術(shù)組。以上三項結(jié)果表明，心梗后 CHF大鼠發(fā)生了心臟炎癥反應(yīng)及全身炎癥反應(yīng)。
　　3.在心梗后CHF狀態(tài)下，心肌細胞TLR4的mRNA及蛋白表達量均增加
　?。?）在心梗后CHF心臟，缺血梗死區(qū)及遠端區(qū)TLR4的mRNA和蛋白表達量均顯著升高；免疫熒光組織化學(xué)顯示假手術(shù)心肌TLR4陽性信號呈斑片狀分布，而CHF心肌TLR4陽性信號分布更廣泛、且強度更高，主要分布于梗死周邊區(qū)和遠端區(qū)的心肌細

10、胞，浸潤心肌的白細胞則基本檢測不到TLR4陽性信號。（2）從CHF心臟急性消化分離心肌細胞，免疫熒光細胞化學(xué)顯示TLR4陽性信號增強，該陽性信號主要分布于細胞膜，而胞漿內(nèi)分布相對較少且不均一。（3）從 CHF心臟急性消化分離心肌細胞，其TLR4的mRNA和蛋白含量均顯著高于假手術(shù)組心肌細胞。以上結(jié)果表明，CHF心肌細胞TLR4的表達量上調(diào)。
　　4. CHF心肌細胞的TLR4與PAMP和DAMP配體分子的最大結(jié)合能力增強
　

11、　從心梗后CHF心臟消化分離出心肌細胞，與TLR4特異性PAMP配體LPS或者DAMP配體HSP60共孵育（LPS和HSP60均帶有熒光探針標(biāo)記），在激光共聚焦顯微鏡下觀察到CHF心肌細胞與LPS和HSP60的結(jié)合熒光均增強，且anti-TLR4抗體預(yù)處理顯著減少LPS和HSP60與心肌細胞的結(jié)合。依據(jù)熒光強度值擬合的結(jié)合曲線顯示，CHF心肌細胞TLR4與LPS和HSP60的最大結(jié)合能力(maximum binding capacity

12、，Bmax)均增加，而解離常數(shù)(dissociation constant，Kd)則沒有明顯改變；此外，結(jié)合曲線也顯示anti-TLR4抗體預(yù)處理使得LPS和HSP60與心肌細胞的結(jié)合量顯著下降。上述結(jié)果表明，CHF心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體分子的最大結(jié)合能力增強。
　　5. CHF心肌細胞的TLR4具有致炎效應(yīng)
　　從心梗后CHF心臟消化分離出心肌細胞，分別給予TLR4特異性PAMP配體LPS或者DAMP配體

13、HSP60進行刺激，檢測到大量炎癥因子被誘導(dǎo)產(chǎn)生，TNFa和IL-6表達和釋放量均顯著高于假手術(shù)組心肌細胞；用TLR4抗體封閉后，LPS和HSP60誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子大幅減少。該結(jié)果表明，CHF心肌細胞TLR4促進心肌炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果顯示：心梗后CHF心臟的心肌細胞TLR4表達上調(diào)，心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體的結(jié)合能力增強，促炎作用也增強。該結(jié)果表明，心肌細胞TLR4受體表達和功能上調(diào)是C