非停跳冠脈搭橋?qū)π募〖?xì)胞TLR4與mRNA，HSP活性表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、近40年來，隨著體外循環(huán)CPB技術(shù)和心肌保護(hù)方法的發(fā)展，在體外循環(huán)下進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(ONCAB)已成為心肌再血管化標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)方法，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)，是讓心臟搏出的血從主動(dòng)脈經(jīng)過所架的血管橋，流向因引起狹窄或梗阻的冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端而到達(dá)缺血的心肌，從而改善心肌的缺血、缺氧狀態(tài)的治療方式。
　　 目前世界上大多數(shù)搭橋手術(shù)仍在CPB下進(jìn)行。其優(yōu)點(diǎn)是心臟停止跳動(dòng)，術(shù)野靜止、無血，便于準(zhǔn)確完全地進(jìn)行冠脈搭橋，操作方便安全。大量事實(shí)證明其具有

2、良好的早期及遠(yuǎn)期效果。CPB技術(shù)已比較成熟，但對(duì)機(jī)體來說，仍是一種不正常狀態(tài)，可帶來一系列病理生理紊亂，如炎性反應(yīng)、血液破壞、血液稀釋、顆粒和異物栓子形成、缺血再灌注損傷，可能加重嚴(yán)重肺、腦、腎患者的病情。
　　 近十年來，隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，開展了通過心臟不停跳和不需要體外循環(huán)的方法來完成搭橋手術(shù)，即非體外循環(huán)心臟跳動(dòng)下搭橋手術(shù)(OPCAB)。這也是心臟穩(wěn)定裝置的不斷改進(jìn)與心臟外科手術(shù)完美結(jié)合的結(jié)果。它使心臟需要搭橋的一

3、小部分保持極小的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，而整個(gè)心臟的絕大部分在正常跳動(dòng)和持續(xù)工作為全身供血，減少了心肌再灌注損傷，成功的減少了手術(shù)并發(fā)癥和促進(jìn)早期康復(fù)。
　　 非體外循環(huán)心臟跳動(dòng)下搭橋手術(shù)拓寬了冠脈搭橋手術(shù)的適應(yīng)證。對(duì)于高危病人，尤其是伴有肺、腎、神經(jīng)系統(tǒng)以及嚴(yán)重左心功能不全的病人更適合于非體外循環(huán)心臟跳動(dòng)下搭橋。這種方法使手術(shù)后的恢復(fù)過程更平穩(wěn)順利。術(shù)后發(fā)生重要臟器功能衰竭的發(fā)生率減少。
　　 如今，非停跳冠脈搭橋(OPCABG)雖

4、有取代停跳冠脈搭橋(CABG)的趨勢(shì)，但其本身始終也存在缺血再灌注損傷的問題。只有充分認(rèn)識(shí)和解決OPCABG中缺血再灌注損傷這一問題，心臟才會(huì)得到強(qiáng)有力的保護(hù)。
　　 Toll樣受體是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體，在天然免疫反應(yīng)中具有重要作用。Toll樣受體4(TLR4)不僅是介導(dǎo)脂多糖信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，而且也參與了缺血性損傷等非病原微生物性炎癥反應(yīng)。有關(guān)TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在冠心病中的作用日益引起人們的關(guān)注

5、。深入研究TLR4在冠心病中的作用，有可能為進(jìn)一步揭示冠心病的發(fā)病機(jī)制并為尋求有效的防治措施提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　 本研究項(xiàng)目首先以SD大鼠建立OPCABG模型，然后獲取心肌組織經(jīng)電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)采用分子生物學(xué)方法分析心肌細(xì)胞中TLR4與mRNA，HSP60在不同時(shí)間段活性表達(dá)的變化，以期明確大鼠OPCABG中上述觀察指標(biāo)之間的關(guān)系。
　　 1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)

6、動(dòng)物研究所提供，其TLR4基因存在點(diǎn)突變，對(duì)內(nèi)毒素天然耐受。30只大鼠，16～18周齡，體重250～320g。共分2個(gè)小組，假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)。缺血再灌注組大鼠被鉗夾冠脈主干，3分鐘后撤去鉗夾，以此模仿冠脈搭橋后造成的急性缺血再灌注損傷。每組再分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為冠脈主干鉗夾后O、l、6、12、24h，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上處死3只大鼠。在上述時(shí)間點(diǎn)，給以腹腔內(nèi)注射過量的戊巴比妥鈉(80mgPkg)處死大鼠，快速低溫

7、剪取心肌組織。
　　 2心臟TLR4mRNA表達(dá)
　　 按說明書操作進(jìn)行PCR反應(yīng)。
　　 3心臟組織熱休克蛋白60(HSP60)含量檢測(cè)應(yīng)用HSP-AELISA試劑盒檢測(cè)，具體操作按說明書進(jìn)行.
　　 4心臟組織電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取大鼠心肌組織，電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理目的基因電泳條帶密度值以灰度@面積、參照物的值表示。所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)均以x±s表示，

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t-test。
　　 1.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)HSP60水平并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果在假手術(shù)組和缺血再灌注組HSP60水平間差別有顯著性意義(P(0.01)；缺血再灌注組HSP60水平明顯高于假手術(shù)組。
　　 2.Sham組心肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變不明顯；IR組心肌損傷較重，缺血心肌恢復(fù)血液灌注8h內(nèi)，其病理學(xué)變化未見顯著改善。
　　 3.Sham組與IR組TLR4蛋白都有陽性表達(dá)，

9、IR組TLR4表達(dá)增加，且以再灌注lh最明顯(19.62±3.84，P(0.01)。
　　 4.與Sham組比較，IR組心肌TLR4mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度上調(diào)，以再灌注1h達(dá)到峰值[(4.03±0.85)×10^-2，P<0.01]，而Sham組各時(shí)間點(diǎn)未見明顯改變。
　　 5.心肌TLR4mRNA表達(dá)與HSP呈正相關(guān)(r=O.728，P<0.01)。
　　 1.心肌Toll樣受體4與mRNA表達(dá)水平呈正

10、相關(guān)表達(dá)，TLR4在心肌早期心肌缺血再灌注后的上調(diào)和活化表明Toll樣受體4在心肌缺血再灌注中可能發(fā)揮重要作用。
　　 2.熱休克蛋白60陽性染色，觀察缺血再灌注組，Toll樣受體4與蛋白的水平明顯增加，而且高峰在1小時(shí)后灌注。此外，在缺血再灌注組，Toll樣受體4與mRNA水平也上調(diào)了。
　　 3.TLR4水平與mRNA，HSP,表達(dá)積極。心肌Toll樣受體4表達(dá)在早期心肌缺血再灌注時(shí)升高。Toll樣受體4激活可能在心