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文檔簡介
1、目的:探討人白血病相關(guān)蛋白16(LeukemiaRelatedProtein16,LRP16)調(diào)控LPS/TLR4信號通路的作用與機制研究。
方法:
(1).建立抑制或過表達LRP16基因的3T3-L1穩(wěn)定細胞系
a.將3T3-L1細胞按80%密度接種于6cm培養(yǎng)皿中,24h后按lipofectamine2000說明書將pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1轉(zhuǎn)染細胞,24h后更換為含800μg/mlG
2、418的DMEM培養(yǎng)基進行抗性篩選3周,以后用含400μg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,構(gòu)建過表達LRP16細胞系3T3-L1-16及對照細胞系3T3-L1-3.1。用WesternBlot的方法進行檢驗。
b.針對已經(jīng)篩選確定的含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的LRP16基因的siRNA靶序列合成OligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與pENTR/U6載體連接產(chǎn)生LV-siLRP16慢病毒載體,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α,挑取重組陽性菌
3、落進行PCR及測序鑒定。將LV-siLRP16及包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,產(chǎn)生慢病毒顆粒,運用Q-RCR檢測病毒滴度。將慢病毒顆粒感染3T3-L1細胞后用4μg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin)進行抗性篩選3周,以后用含2μg/mlBlasticidin的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。構(gòu)建抑制LRP16表達細胞系3T3-L1-374及對照細胞系3T3-L1-GFPi。用WesternBlot的方法進行檢驗。
(2).L
4、RP16對3T3-L1脂肪細胞LPS/TLR4信號通路的影響
a.收集不同濃度LPS刺激后4、8、12、24h細胞蛋白,WesternBlot法檢測LRP16蛋白表達水平;
b.抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374及對照細胞3T3-L1-GFPi加入1μg/mlLPS刺激60min,用RT-PCR和WesternBlot檢測細胞TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6mRNA及蛋白表達;
c.W
5、esternBlot檢測LRP16對無LPS刺激,上述受體的蛋白表達;d.WesternBlot法檢測NF-κB蛋白表達;
e.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-6蛋白水平。
(3).LRP16對LPS誘導(dǎo)下MAPK信號通路的影響
用1μg/mlLPS刺激脂肪細胞60min,收集細胞蛋白,Westernblot檢測抑制或過表達LRP16后,對ERK1/2、p38、JNK蛋白表達的影響。
6、> (4).LRP16對LPS誘導(dǎo)下3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響
a.MTT法繪制細胞增殖曲線;
b.Westernblot檢測過表達或抑制LRP16后Akt蛋白表達的變化。結(jié)果:
(1).建立抑制或過表達LRP16基因的3T3-L1穩(wěn)定細胞系
a.用SuperFect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別把質(zhì)粒pcDNA3.1-LRP16和空白質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)入3T3-L1細胞中,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定
7、過表達LRP16的細胞株。采用Westernblot技術(shù)檢測LRP16蛋白的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達LRP16基因細胞系(3T3-L1-16)的LRP16蛋白含量約是對照組細胞系(3T3-L1-3.1)目的蛋白含量的2.37倍(p<0.05)。
b.構(gòu)建針對LRP16基因的shRNA慢病毒表達載體,該病毒轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細胞后Blasticidin篩3周。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞顯示慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達到80%-90%,Wes
8、ternblot檢測顯示抑制LRP16表達細胞系(3T3-L1-374)的LRP16蛋白減少至對照組細胞系(3T3-L1-GFPi)的40.6%(p<0.01)。
(2).LRP16對3T3-L1脂肪細胞LPS/TLR4信號通路的影響
a.LPS可影響LRP16的蛋白表達水平:LRP16蛋白表達在LPS刺激后4h未發(fā)生明顯變化,8h、12h均呈劑量依賴性增高,24h蛋白表達呈劑量依賴性降低。
b.RT-PC
9、R結(jié)果顯示:抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6mRNA的表達水平,相對于對照細胞3T3-L1-GFPi分別減少至58%、62.4%、60%和56%(P<0.05)。WesternBlot結(jié)果顯示:抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374中TLR4和MyD88蛋白表達相對于對照細胞3T3-L1-GFPi分別減少至58.1%和60%(P<0.05),IRAK-1和TRAF6蛋白表達減
10、少至50%和42%,顯著低于對照細胞(P<0.01)。
c.WesternBlot結(jié)果顯示:無LPS刺激,抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6的蛋白表達較對照細胞3T3-L1-GFPi無明顯變化(p>0.05)。
d.抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374中NF-κB核蛋白表達相對于對照細胞3T3-L1-GFPi減少至61%(P<0.05)。
e.培
11、養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6的蛋白含量減少至對照細胞的65%和68%(P<0.05)。
(3).LRP16對LPS誘導(dǎo)下MAPK信號通路的影響
WesternBlot結(jié)果顯示:過表達LRP16細胞3T3-L1-16的p-ERK1/2、p-p38和p-JNK較對照細胞3T3-L1-3.1明顯增加(p<0.01);而抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374的p-ERK1/2、p-p38和p-JNK,較對照細胞3T3-L
12、1-GFPi明顯減少(p<0.01)。
(4).LRP16對LPS誘導(dǎo)前脂肪細胞增殖的影響
a.MTT結(jié)果顯示:過表達LRP16前脂肪細胞增殖較對照組明顯減緩。
b.WesternBlot結(jié)果顯示:抑制LRP16表達細胞3T3-L1-374的p-serine-473Akt明顯較對照細胞3T3-L1-GFPi增多;過表達LRP16細胞3T3-L1-16的p-serine-473Akt,明顯較對照細胞3T3-L
13、1-3.1減少。
結(jié)論:
(1).成功構(gòu)建了過表達LRP16細胞系、抑制表達LRP16細胞系及對照細胞系,為后續(xù)實驗研究提供了穩(wěn)定的細胞模型。
(2).抑制LRP16基因可阻斷LPS/TLR4信號通路的激活,下調(diào)TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6的表達,這可能是其對TLR4信號通路的負性調(diào)控機制之一;且LRP16可能通過下調(diào)TLR4信號通路,抑制NF-κB通路活性,減少通路下游炎癥因子TNF-α
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