LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的相關性研究及LRP16單克隆抗體的制備及應用.pdf

1、LRP16基因是1999年從正常成人外周血淋巴細胞中克隆獲得的。LRP16基因定位于染色體11q11.2，是一雌激素(E2)反應性基因，它在多種雌激素依賴性腫瘤中高表達。 在既往的研究中發(fā)現(xiàn)LRP16過表達不僅能促進乳腺癌MCF-7細胞增殖，而且促進細胞的侵襲生長，并研究中證實LRP16基因通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白E(cyclin E)以及細胞周期蛋白D1的表達，促進了G1/S期的轉換；抑制LRP16可降低MCF-7細胞的侵襲生長能

2、力，其機制涉及E-鈣黏著素(E-cadherin)基因的變化。對LRP16分子的活性研究也發(fā)現(xiàn)，LRP16是ERα的一個共激活因子，該作用方式不依賴于E2的存在，但E2可增強二者的作用。因此，我們認為，LRP16在ERα陽性乳腺癌的發(fā)生與進展中應有重要作用，抗LRP16的治療可能有利于ERα陽性乳腺癌的好轉。 因子宮內(nèi)膜樣腺癌與乳腺癌同屬于激素相關性腫瘤，且我們在Ishikawa細胞中的研究也發(fā)現(xiàn)LRP16促進細胞的侵襲生長，分

3、子水平的研究也涉及E-Cadherin基因的變化。因此本實驗的第一部分通過對子宮內(nèi)膜樣腺癌的臨床病例標本進行分析，在蛋白水平上進一步闡明LRP16與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預后的關系。 隨著對LRP16基因研究的不斷深入，我們越來越發(fā)現(xiàn)它在激素相關性腫瘤的發(fā)生與進展中有重要的作用，因此制備效價高、特異性強的單克隆抗體是非常必要的。本實驗的第二部分就是LRP16單克隆抗體的制備。LRP16McAb有利于對LRP16的組織分布和功能的進一步研

4、究，也為腫瘤疫苗的研制和臨床研究創(chuàng)造條件。 第一部分、LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的相關性研究 目的：探討LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌(EEC)中的表達及與臨床病理的相關性。 方法：用免疫組化法檢測76例EEC患者癌組織標本中LRP16和雌激素受體α(ERα)、孕激素、E-Cadherin的表達水平。 結果：LRP16核陽性率為67.11％(51/76)，LRP16漿陽性率為96.05％(73/76)，漿核

5、均陽性占64.47％(49/76)；ERα陽性占51.32％(39/76)，陰性占48.68(37/76)．ERα陰性患者中LRP16核陽性率(86.49％，32/37)明顯高于ERα陽性患者(48.71％，19/39)(P＜0.01)，LRP16在胞核中表達與EEC患者的手術病理分期無顯著相關性(P＞0.05)，但組織學分級和E-Cadherin的表達呈相關(P＜0.05)。胞漿中分布的LRP16與ERα表達無關(P＞0.05)，但胞

6、漿中的LRP16與EEC的手術病理分期呈明顯的負相關(P＜0.01)，與PR的表達呈正相關(P＜0.05)，與組織學分級則無顯著相關性(P＞0.05)。在LRP16核漿均陽性的病例中，ERα陰性患者(81.08％，30/37)的比例明顯高于ERα陽性患者(48.72％，19/39)(P＜0.01)；且LRP16在核漿中均有表達與EEC患者的手術病理分期及組織學分級無顯著相關性(P＞0.05)。在EEC腫瘤細胞中核、漿分布的LRP16著色

7、強度呈負相關(P＜0.05)。 結論：LRPl6在EEC細胞中均有表達，但其亞細胞分布與ERa狀態(tài)密切相關，LRP16在胞漿中的表達可能提示良好預后。胞核中的LRP16表達與腫瘤的侵襲性相關。胞核、胞漿的亞細胞定位改變可能提示腫瘤的惡性演進。因此，本文認為LRP16基因可能EEC中是一重要的監(jiān)測因子。 第二部分、LRP16單克隆抗體的制備及應用 目的：研制LRP16單克隆抗體。 方法：采用LRP16抗原免

8、疫小鼠，用免疫的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞通過PEG4000融合，以HAT和HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽性孔和有限稀釋法克隆細胞后，接種小鼠腹腔制備腹水抗體，抗體純化采用以SPA-Sepharose-6BFF為固定相的親和層析法，Westernblot、免疫組化和間接ELISA法鑒定抗體的特異性、Ig亞型和效價。 結果：獲得一株穩(wěn)定分泌抗LRP16單克隆抗體的雜交瘤細胞，染色體眾數(shù)為95，其腹水抗體和純化的抗體效