LRP16基因對細胞胰島素抵抗的影響及分子機制.pdf

1、目的：探討人白血病相關蛋白16（Leukemia Related Protein 16，LRP16）對3T3-L1脂肪細胞、C2-C12成肌細胞、HepG2肝癌細胞胰島素抵抗的影響及可能的分子機制。
　　 方法：（1）利用脂質體轉染及慢病毒介導的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）技術構建過表達LRP16細胞系、抑制表達LRP16細胞系及對照細胞系。（2）將3T3-L1前脂肪細胞常規(guī)誘導成熟，

2、倒置顯微鏡觀察及油紅染色判斷過表達及抑制表達LRP16對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響；Q-PCR（Real-time Quantitative PCR）法檢測過表達及抑制表達LRP16對3T3-L1脂肪細胞分化相關因子CAAT增強子結合蛋白α（CAAT/Enhancer Binding Protein alpha，C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator activated rec

3、eptor gamma，PPARγ），以及腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNFα）、白介素（Interleukin，IL）-6、抵抗素（Resistin）、脂聯(lián)素（Adiponectin）mRNA表達的影響。（3）2-deoxy-[3H]-D-glucose檢測過表達及抑制表達LRP16對3T3-L1脂肪細胞、C2-C12成肌細胞、HepG2肝癌細胞胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖攝取率的影響；Weste

4、rn Blot法檢測上述細胞中過表達及抑制表達LRP16對胰島素受體底物（Insulin Receptor Substrate，IRS）-1信號通路關鍵蛋白pIRS-1（Ser307）、pIRS-1（Tyr）、PI3-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）表達的影響。（4）將pCMX-PPARγ（pCMX-PPARα）、pGL3-PPRE、pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-16、pRL-TK共轉染COS-

5、7細胞，雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測過氧化物酶體增生因子反應元件（Peroxisome Proliferator Response Element，PPRE）相對熒光素酶活性以反映PPARγ及過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome Proliferator activated receptor alpha，PPARα）的轉錄活性；Western Blot法檢測過表達及抑制表達LRP16對3T3-L1脂肪細胞，C2-C12成肌細

6、胞PPARγ、葡萄糖轉運蛋白（Glucose Transporter，GLUT）-4表達的影響，及對HepG2肝癌細胞PPARα、脂蛋白脂取Lipoprotein Lipase，LPL）蛋白表達的影響。
　　 結果：（1）成功構建了過表達及抑制表達LRP16的3T3-L1、C2-C12、HepG2細胞系與對照細胞系。（2）過表達LRP16的脂肪細胞脂滴大而少，分散而不均勻，呈明顯指環(huán)樣的脂滴較少，油紅O染色示570nmOD值低于

7、對照細胞；抑制表達LRP16的脂肪細胞脂滴小而多，密集而均勻，整個視野呈“油菜花樣”改變，油紅O染色示570nm OD值高于對照細胞.過表達LRP16的脂肪細胞C/EBPα、PPARγ及脂聯(lián)素mRNA表達低于對照細胞，TNFα、IL-6、抵抗素的mRNA表達高于對照細胞；抑制表達LRP16的脂肪細胞C/EBPα、PPARγ，及脂聯(lián)素mRNA表達高于對照細胞，TNFα，IL-6、抵抗素的mRNA表達低于對照細胞。（3）過表達LRP16抑制

8、3T3-L1脂肪細胞、C2-C12成肌細胞及HepG2肝癌細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，抑制表達LRP16則增加3T3-L1脂肪細胞、C2-C12成肌細胞及HepG2肝癌細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取。過表達LRP16上調三種細胞pIRS-1（Ser307）蛋白的表達，下調pIRS-1（Tyr）、P13-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）蛋白的表達，相反，抑制表達LRP16則下調三種細胞pIRS-1（Ser307

9、）蛋白的表達，上調pIRS-1（Tyr）、PI3-K（p85）、pAkt（Ser473）、pAkt（Thr308）蛋白的表達。（4）LRP16劑量依賴性的降低PPARγ的轉錄活性，當pcDNA3.1-16量為0.4μg時，pGL3-PPRE的相對熒光素酶活性降低為對照組的43％（P<0.01），當pcDNA3.1-16量為0.5μg時，pGL3-PPRE的相對熒光素酶活性降低為對照組的27％（P<0.01）；LRP16劑量依賴性的降低P

10、PARα的轉錄活性：當pcDNA3.1-16量為0.4μg時，pGL3-PPRE的相對熒光素酶活性降低為對照組的38％（P<0.01），當pcDNA3.1-16量為0.5μg時，pGL3-PPRE的相對熒光素酶活性降低為對照組的35％（P<0.01）。過表達LRP16下調3T3-L1脂肪細胞、C2-C12成肌細胞PPARγ、GLUT-4蛋白的表達，抑制表達LRP16則上調3T3-L1脂肪細胞PPARγ、GLUT-4蛋白的表達；過表達LR