

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1、第一部分LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及調(diào)控 目的:①建立子宮內(nèi)膜癌組織LRP16基因mRNA的提取方法;②初步研究子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常子宮內(nèi)膜組織的LRP16基因表達(dá)特點(diǎn),為進(jìn)一步分析LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過(guò)程中的變化特點(diǎn)意義奠定基礎(chǔ)。 方法:收集子宮內(nèi)膜癌手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本和部分臨床病理診斷資料,采用Northern Blot方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌及癌旁臨床組織標(biāo)本的LRP16基因mRNA的表達(dá)水平。
2、 結(jié)果:①成功建立子宮內(nèi)膜癌組織提取LRP16基因的方法。②以β-actin為內(nèi)參照,6例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本中有2例LRP16 mRNA表達(dá)較癌旁正常子宮內(nèi)膜組織明顯增高。 結(jié)論:①LRP16基因作為組成基因在子宮內(nèi)膜組織中均有表達(dá)。②子宮內(nèi)膜癌患者中,1/3患者存在LRP16 mRNA過(guò)表達(dá),提示LRP16基因可能在子宮內(nèi)膜癌組織中存在過(guò)表達(dá)。 第二部分 LRP16基因的多克隆抗體制備及初步應(yīng)用 目的:
3、制備兔抗人LRP16蛋白多克隆抗體,并利用該抗體檢測(cè)LRP16蛋白的在不同組織中的分布特點(diǎn)及亞細(xì)胞定位,初步分析LRP16蛋白在女性生殖系統(tǒng)正常組織及腫瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn),以及與雌激素受體表達(dá)的相關(guān)性。 方法:采用RT-PcR方法提取正常人外周血LRP16基因,采用PCR方法擴(kuò)增后,與PT-Adv載體連接,表達(dá)產(chǎn)物提取質(zhì)粒,測(cè)序無(wú)誤后進(jìn)行雙酶切,重新連接LRP16基因和原核表達(dá)載體pRSET-C,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)缺
4、陷型大腸桿菌。誘導(dǎo)該基因原核表達(dá),快速蛋白免疫法免疫新西蘭長(zhǎng)毛兔,ELISA法監(jiān)測(cè)抗體效價(jià),獲取抗LRP16基因的多克隆抗體。利用Western blot方法檢測(cè)該抗體在不同LRP16基因抑制率的乳腺癌系MCF-7的結(jié)合效率,評(píng)價(jià)該多克隆抗體的免疫學(xué)活性及免疫學(xué)特異性。采用免疫組化法觀察LRP16基因產(chǎn)物在女性子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異。 結(jié)果:成功獲得高效的LRP16多克隆抗體,該
5、多克隆抗體具備良好的免疫學(xué)活性及特異性。利用該抗體初步證實(shí)LRP16基因編碼產(chǎn)物主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá),且以上皮細(xì)胞為主。LRP16蛋白表達(dá)與雌激素受體表達(dá)可能存在正相關(guān)。 結(jié)論:制備的LRP16抗體及其全長(zhǎng)基因可用于LRP16基因的生理功能及病理學(xué)研究,LRP16基因主要在生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞,尤其是上皮細(xì)胞中表達(dá)。初步發(fā)現(xiàn)LRP16基因的表達(dá)與雌激素受體呈正相關(guān)。 第三部分 LRP16通過(guò)ERα介導(dǎo)抑制了Ishikaw
6、a細(xì)胞中E-鈣黏著素的轉(zhuǎn)錄活性 目的:既往研究表明LRP16基因過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)E-鈣黏著素蛋白(E-cadherin)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的侵襲生長(zhǎng),本研究目的在于探討LRP16下調(diào)E-cadherin的分子途徑。 方法:免疫組化方法檢測(cè)LRP16基因表達(dá)Ishikawa細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá);共轉(zhuǎn)染與熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LRP16基因?qū)-cadherin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響;染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢
7、測(cè)雌激素受體α(ERα)與LRP16在E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的招募狀況。 結(jié)果:E-cadherin在LRP16過(guò)表達(dá)的Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下調(diào);LRP16抑制了E-cadherin啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,該效應(yīng)呈現(xiàn)對(duì)雌激素(E2)存在的依賴性特征;LRP16本身沒(méi)有與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,但明顯抑制了ERα與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。 結(jié)論:LRP16通過(guò)抑制ERα對(duì)E-cadhe
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