RAGE抗體對大鼠膽道梗阻性肝損傷的抑制作用及其機(jī)理研究.pdf

1、近年來，由膽道梗阻性肝損傷引起的急性肝損傷和肝纖維化/肝硬化患者日趨增多，嚴(yán)重威脅著人類健康。本文從制備高活性高純度低內(nèi)毒素的重組小鼠G-CSF蛋白及重組大鼠sRAGE蛋白入手，經(jīng)免疫新西蘭大白兔及利用抗原親和純化，制備具有高特異性的兔抗大鼠 RAGE多克隆抗體，以此作為治療膽道梗阻性肝損傷新蛋白藥物的原料，然后采用膽道梗阻性肝損傷動(dòng)物模型--大鼠膽管結(jié)扎(BDL)模型，研究其藥效，并從基因角度探究其作用機(jī)理，旨在為探索和研究治療膽道梗

2、阻性肝損傷的新藥物提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、選擇小鼠G-CSF（mG-CSF）和大鼠sRAGE（rsRAGE）兩個(gè)蛋白作為候選藥物并進(jìn)行表達(dá)純化。構(gòu)建了 pET-30a(+)-mG-CSF表達(dá)質(zhì)粒并利用大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）表達(dá)系統(tǒng)獲得了高純度、低內(nèi)毒素和高生物學(xué)活性的G-CSF蛋白，并且發(fā)現(xiàn)重組小鼠G-CSF蛋白對肝纖維化的治療并無顯著效果。
　　2、構(gòu)建了 rsRAG

3、E-pPICZαA表達(dá)質(zhì)粒并利用畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）表達(dá)系統(tǒng)獲得了高產(chǎn)量、高純度、低內(nèi)毒素和高生物學(xué)活性的重組大鼠sRAGE蛋白。研究還揭示了重組大鼠sRAGE蛋白可顯著降低CCl4導(dǎo)致的大鼠肝纖維化。
　　3、通過免疫新西蘭大白兔及純化獲取了具有高特異性的兔抗大鼠 RAGE多克隆抗體，同時(shí)應(yīng)用大鼠膽管結(jié)扎模型，研究了 RAGE抗體在膽道梗阻性肝損傷的作用。結(jié)果顯示 RAGE抗體可顯著

4、改善大鼠生長和生存狀況；同時(shí)在對肝臟組織的H&E和MASSON染色中發(fā)現(xiàn)該抗體可顯著降低膽阻性的肝壞死，炎癥，纖維化和膽管增生。血清學(xué)指標(biāo)也發(fā)現(xiàn) RAGE抗體可顯著改善膽阻引起的肝功能損傷和肝纖維化。
　　4、通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，初步探索了RAGE抗體在膽道梗阻性肝損傷中的作用機(jī)理。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組化和熒光定量技術(shù)發(fā)現(xiàn) RAGE抗體可顯著抑制炎癥因子 IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平以及其在損傷部位的表達(dá)，從而降低肝臟壞死/炎癥；RAG

5、E抗體可顯著地調(diào)節(jié)MMPs/TIMP-1的表達(dá)水平，降低肝纖維化；RAGE抗體還可顯著地調(diào)節(jié)Cyp7α1的表達(dá)水平，以降低膽管增生。通過體外LX-2肝星狀細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了RAGE抗體可顯著降低Col1α1和MMP-9的表達(dá)水平。最后，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)了RAGE抗體可顯著降低肝星狀細(xì)胞的活力。
　　綜上研究表明，通過檢測和分析各類肝硬化相關(guān)基因的表達(dá)變化，RAGE抗體對膽道梗阻性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用；同時(shí)，體外肝星狀細(xì)胞