勃利霉素對(duì)卵菌抑制作用機(jī)理研究.pdf

1、卵菌包含許多嚴(yán)重危害農(nóng)作物的病原菌，例如大豆疫霉、致病疫霉等。大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是一種危害極為嚴(yán)重的世界性大豆病害之一。卵菌病害的防治主要采用化學(xué)殺菌劑，甲霜靈(Metalay)作為防治卵菌病害的特效藥，目前抗性問題日益嚴(yán)重。因此，研發(fā)出更為有效的的生物源殺卵菌劑已是刻不容緩。由鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類化合物勃利霉素高效抑制大豆疫霉菌絲生長。勃利霉素對(duì)大豆疫霉抑制作用的分子機(jī)制還有待深入研究。
　　 本研究利用蘇氨酸體外

2、添加實(shí)驗(yàn)初步確定了勃利霉素對(duì)大豆疫霉抑制作用的分子靶標(biāo)為大豆疫霉的細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶(threonyl-tRNA synthetase，ThrRS)，并通過體外酶活測定、熒光光譜分析和停留光譜等全面分析了勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的抑制作用機(jī)理。除此之外，利用生物信息學(xué)分析進(jìn)一步預(yù)測了勃利霉素可能對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶具有抑制作用。結(jié)果如下:
　　 (1)在含勃利霉素的大豆疫霉胡蘿卜瓊

3、脂(carrot agar medium，CA)培養(yǎng)基中添加蘇氨酸，可以明顯緩解勃利霉素對(duì)大豆疫霉優(yōu)勢小種1菌絲生長的抑制作用，蘇氨酸與勃利霉素對(duì)大豆疫霉菌絲生長抑制作用之間存在劑量關(guān)系，即隨著蘇氨酸的濃度增加，勃利霉素對(duì)大豆疫霉菌絲生長抑制作用減弱，這種現(xiàn)象在其它對(duì)照氨基酸中沒有觀察到，因此可以根據(jù)蘇氨酸與勃利霉素對(duì)大豆疫霉菌絲生長抑制作用之間的劑量效應(yīng)初步確定勃利霉素對(duì)大豆疫霉抑制作用的靶標(biāo)為蘇氨酰-tRNA合成酶。
　　

4、(2)利用生物信息學(xué)分析在大豆疫霉基因組內(nèi)確定其細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶為勃利霉素作用靶標(biāo)。利用基因組PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得大豆疫霉優(yōu)勢小種1的細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶基因，利用基因工程技術(shù)將其克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行體外表達(dá)。利用低溫誘導(dǎo)和鎳柱純化獲得了可溶性的大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶。
　　 (3)建立了非放射性方法測定蘇氨酰-tRNA合成酶催化蘇氨酸

5、活化反應(yīng)的催化活性:通過離心去除結(jié)合到凝膠上的反應(yīng)生成物ThrRS·Thr～AMP復(fù)合物，反應(yīng)液上清中的底物蘇氨酸利用氨基酸衍生法和高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測，由此計(jì)算蘇氨酸活化反應(yīng)中生成物的量來測定勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的酶活性抑制的IC50。勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的酶活性的抑制常數(shù)K(app)為10μM，IC50為8μM，實(shí)驗(yàn)測定所用的酶濃度為4μM。由此可見，勃利霉素對(duì)大豆疫霉的抑制作

6、用是由抑制大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶催化反應(yīng)引起的。
　　 (4)為進(jìn)一步明確勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的抑制作用機(jī)制，利用光譜技術(shù)研究勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的相互作用，揭示其結(jié)合特性。結(jié)果表明勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，其在大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶上有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。兩者有較強(qiáng)的結(jié)合親和性，結(jié)合常數(shù)(binding cons

7、tant) KA為2.552×105 M-1。熱力學(xué)常數(shù)△G＜0，△H=85.024 kJ mol-1，△S=0.372 kJ mol-1K-1，這說明勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)的過程，主要作用力是疏水作用力。根據(jù)F(o)rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合距離為6.39 nm。因此，勃利霉素通過與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶形成復(fù)合體發(fā)揮其抑

8、制作用。
　　 (5)利用圓二色光譜法研究勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶結(jié)合前后，蛋白質(zhì)微環(huán)境及構(gòu)型的改變。結(jié)果表明，勃利霉素與蘇氨酰-tRNA合成酶結(jié)合導(dǎo)致α-螺旋含量升高，β-折疊含量下降，兩者同時(shí)發(fā)生變化。蘇氨酰-tRNA合成酶屬于α+β蛋白，由此可知，勃利霉素在與蘇氨酰-tRNA合成酶形成復(fù)合體的過程中，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大影響，可能結(jié)合在其催化活性位點(diǎn)區(qū)域。為進(jìn)一步確定勃利霉素在大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tR

9、NA合成酶結(jié)合位點(diǎn)與底物結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系，利用圓二色滴定檢測勃利霉素在底物存在下對(duì)大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，底物的結(jié)合位點(diǎn)與勃利霉素的結(jié)合位點(diǎn)并不重疊，勃利霉素是大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶非競爭性抑制劑。
　　 (6)利用停留光譜進(jìn)一步對(duì)勃利霉素與疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶結(jié)合的前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，勃利霉素與大豆疫霉蘇氨酰-tRNA合成酶快速結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)kon

10、為4.381×106 M-1 s-1，Kd為22.8 nM，勃利霉素與致病疫菌蘇氨酰-tRNA合成酶kon為4.612×106 M-1 s-1，Kd為21.7 nM，接近于勃利霉素對(duì)大腸桿菌快速結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)值(kon=5×106 M-1 s-1，Kd＜20 nM)。底物存在情況下，勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶快速結(jié)合仍檢測到明顯的熒光猝滅作用，進(jìn)一步說明底物與勃利霉素在大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶具有不同的結(jié)

11、合位點(diǎn)，勃利霉素為大豆疫霉蘇氨酰-tRNA合成酶的非競爭性抑制劑。
　　 (7)多序列比對(duì)分析揭示，大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶與大腸桿菌蘇氨酰-tRNA合成酶具有較高的相似性，大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶勃利霉素結(jié)合的疏水區(qū)(Set-410，His-412，Cys-437，Pro-438，Leu-593，Phe-597)與預(yù)測的大腸桿菌蘇氨酰-tRNA合成酶勃利霉素結(jié)合區(qū)是保守的。利用CA STp-pocket

12、/cavity程序預(yù)測了大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的勃利霉素可能的結(jié)合口袋，結(jié)果表明大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶與大腸桿菌蘇氨酰-tRNA合成酶勃利霉素口袋的氨基酸組成類似，在口袋的體積和面積上有一定差異，大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的勃利霉素結(jié)合口袋稍大，可能有利于勃利霉素的結(jié)合，提高了大豆疫霉對(duì)勃利霉素的敏感性。
　　 (8)作為細(xì)胞周期抑制劑，勃利霉素可能對(duì)大豆疫霉的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白具有抑制作用。

13、利用序列比對(duì)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和保守區(qū)域分析等預(yù)測了與酵母細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdc28高度同源的大豆疫霉細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶psCdc2，為進(jìn)一步深入研究勃利霉素對(duì)大豆疫霉細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的抑制作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本研究從分子水平上闡明了勃利霉素對(duì)大豆疫霉菌絲生長抑制作用的機(jī)理，并全面分析了勃利霉素與大豆疫霉細(xì)胞質(zhì)蘇氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合特性、抑制類型以及兩者結(jié)合對(duì)酶構(gòu)型變化的影響，并對(duì)勃利霉