梗阻性黃疸大鼠血清對肝細胞模型IRE1表達的影響與中藥的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　通過研究不同血清干預后大鼠正常肝細胞中 IRE1α的表達變化，探討梗阻性黃疸肝損傷的發(fā)生機制及中藥茵陳蒿湯對肝細胞的保護機制，為臨床上梗阻性黃疸患者使用清熱利濕中藥提供理論依據。
　　方法：
　　1、選擇30只成年雄性SD大鼠，體重(270-300)g，動物級別為清潔級，隨機分為三組：①梗阻性黃疸組(O組)10只；②假手術對照組(S組)10只；③茵陳蒿湯灌胃組（Y組）10只。S組僅行手術探查、分離膽管，但不

2、予膽管結扎，O組先行手術探查、分離膽管，然后采用雙重線結扎法建立梗阻性黃疸模型，Y組采用茵陳蒿湯灌胃（每次劑量1mL/100g體重），三組均于術后5d經腹主動脈取血，部分血液標本：檢測比較各組動物血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)指標含量；其余血液標本離心后保留血清備用。
　　2、選取大鼠正常肝細胞系BRL-3A，購自中國科學院細胞庫。分為A、B、C三組，其中①A組為加入

3、含正常大鼠血清的培養(yǎng)基；②B組為加入含梗阻性黃疸大鼠血清的培養(yǎng)基；③C組為加入含梗阻性黃疸大鼠血清及茵陳蒿湯灌胃大鼠血清的培養(yǎng)基。分別于6h、24h、48h取材，離心后取肝細胞及培養(yǎng)液上清。分別標記為A6h、A24h、A48h、B6h、B24h、B48h、C6h、C24h、C48h。肝細胞應用蛋白質印跡法(western blot)測定肝組織中IRE1α蛋白表達變化，應用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測大鼠肝組織 IRE1α基

4、因表達情況；培養(yǎng)液上清測量ALT、AST含量。
　　結果：
　　1、生化指標：①動物實驗造模取血清部分：O組TBIL、DBIL、ALT、AST值較正常值明顯升高，分別S組對比均明顯升高，差異都有統(tǒng)計學意義（P<0.05），大鼠梗阻性黃疸模型建立成功。②細胞實驗部分培養(yǎng)液測定 ALT、AST：以 A組為對照組，B組及C組的ALT、AST水平在各個時間點的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的ALT、AST水平在各個時間點

5、的均低于B組（P<0.05）。
　　2、采用western blot檢測大鼠肝細胞中IRE1α：在蛋白表達水平上，以Actin為內參。以A組為對照組，B組及C組的IRE1α表達水平在各個時間點的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的IRE1α表達水平在各個時間點的均低于B組（P<0.05）。
　　3、R-T PCR檢測大鼠肝細胞中IRE1αmRNA基因：以A組為對照組，B組及C組的IRE1αm-RNA表達水平在各個時間

6、點的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的IRE1αm-RNA表達水平在各個時間點的均低于B組（P<0.05）。
　　結論：
　　1、正常大鼠肝細胞培養(yǎng)過程中加入梗阻性黃疸大鼠血清能夠成功制造肝損傷模型。由IRE1α-JNK介導ERS途徑的肝細胞凋亡，是梗阻性黃疸引起肝損傷的可能機制。
　　2、正常大鼠肝細胞梗阻性黃疸肝損傷模型中加入茵陳蒿湯含藥血清仍能改善肝功能，可能是通過抑制IRE1α蛋白的過度激活，從而降低