腫瘤壞死因子-α抗體對梗阻性黃疸大鼠腎功能的影響及其機制的研究.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)是指排泄膽汁的膽道系統(tǒng)因機械性的梗阻,致使膽汁無法順暢地排泄到腸道所引起的黃疸。梗阻性黃疸一般需要手術(shù)治療,其術(shù)后約11％患者會產(chǎn)生腎功能衰竭,死亡率約32％-100％[1].
　　 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種促炎性細胞因子,TNF-α主要是由內(nèi)毒素刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生。梗阻性黃疸時受內(nèi)毒素刺激單核巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)

2、生大量的TNF-α[2],又因為血清中的TNF-α主要在肝臟清除,梗阻性黃疸時肝臟受到損傷使其清除TNF-α的能力大大下降,這導致TNF-α在肝內(nèi)處于較高的水平,Bemelmans[2]通過試驗測定梗阻性黃疸大鼠血液循環(huán)中的TNF-α明顯高于對照組,過多的TNF-α會導致肝、腎功能的損傷。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)[3,4,5]:TNF-α可增強腎小球前小動脈平滑肌細胞內(nèi)的1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol1,4,5-trip

3、hosphate receptor,IP3R)的表達,并可增加細胞外鈣內(nèi)流。OJ時腎損害的發(fā)生與TNF-α增強腎小球前小動脈平滑肌細胞內(nèi)的IP3R的表達,從而增加細胞外鈣內(nèi)流,致使腎皮質(zhì)血流量減少有關(guān)。本研究擬采用膽總管結(jié)扎致梗阻性黃疸大鼠模型,并通過腹腔內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體,病理學觀察OJ大鼠腎臟形態(tài)學改變,通過Western blot和免疫組織化學方法檢測IP3R在腎組織的含量和表達;來研究TNF-α單克隆抗體對梗阻性黃

4、疸大鼠腎功能的影響及其機制。為臨床治療OJ所致腎損害提供理論依據(jù)。
　　 目的:通過膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation,CBDL)制作梗阻性黃疸大鼠模型,并腹腔內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體,研究抑制TNF-α表達后腎臟功能和形態(tài)的變化和IP3R在腎組織表達的變化。
　　 方法:將60只雄性Sprague Dawley大鼠隨機分成假手術(shù)組(sham組)、模型組(分為CBDL術(shù)后1week、2

5、week、3week、4week和5week五個亞組)和干預組(分為CBDL術(shù)后1week干預1week、2week、3week和4week四個亞組)。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk、5wk麻醉動物,干預組于結(jié)扎后第2周開始腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(0.1mg/kg/2d),并于干預后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物,sham組與5wk模型組動物同批麻醉,留取肝、腎組織、血標本。采用肝臟HE染色和Mas

6、son三色染色,腎臟HE染色確定模型建立情況,并與干預組與模型組對比;采用生化方法檢測肝、腎功能變化,通過Western blot方法檢測IP3R的含量;免疫組織化學方法檢測IP3R在腎組織的表達。用單因素方差分析和SNK-q檢驗統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1肝臟及腎臟病理改變
　　 肝臟組織HE及Masson染色顯示:sham組HE染色顯示肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝板排列整齊;Masson三色染色僅在門管區(qū)可見少量

7、結(jié)締組織。CBDL組肝臟小膽管廣泛增生,膽管擴張,纖維組織增生,假小葉形成。干預組大鼠HE染色顯示肝臟小葉結(jié)構(gòu)變化不明顯,小膽管仍有增生;Masson染色顯示門管區(qū)膠原纖維輕微增多,未見假小葉形成。
　　 腎組織HE染色顯示:sham組:腎小球體積形態(tài)正常,腎小管上皮細胞排列規(guī)整,腎臟未見明顯病理改變,僅見少量結(jié)締組織。CBDL組:造模2周時腎細胞腫脹,腎間質(zhì)可見少量炎性細胞浸潤,未見明顯壞死灶,可見黃色顆粒,結(jié)締組織明顯增多;

8、造模5周組腎小管上皮細胞腫脹,排列不規(guī)整,水樣空泡變性、脫落,同時可見局灶上皮細胞壞死,胞漿崩解,間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤,結(jié)締組織增生更加明顯。干預組大鼠腎臟病變較CBDL組明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少,間質(zhì)充血未見,結(jié)締組織較模型組略少。
　　 2肝功能檢測:
　　 造模1周后,CBDL組血漿ALT明顯增高,與sham組比較有明顯差異(P＜0.05)。之后雖逐漸下降,但均明顯高于sham組。TNF-α單克隆抗體干預治

9、療后1周即較同周CBDL組明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),之后呈下降趨勢,至治療后4周仍高于sham組,但是差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3腎功能檢測:
　　 CBDL組在CBDL術(shù)后血漿CREA逐漸上升,于第三周達到峰值之后逐漸下降,但均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預治療后與同周CBDL組比較CREA水平明顯下降(P＜0.05),但仍高于sham組(治療2周組P＜0.

10、05,之后P＞0.05)。
　　 血漿BUN在CBDL術(shù)后造模組明顯升高,與sham組有明顯差異(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預治療后較同周CBDL組明顯下降(P＜0.05),但仍明顯高于sham組(治療2周組P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 4內(nèi)毒素檢測:
　　 CBDL組造模術(shù)后1周起,血漿內(nèi)毒素水平顯著升高,之后在此水平波動,3周時有所下降,但仍顯著高于sham組(P＜0.05)。5周時又

11、回升至術(shù)后1W水平。TNF-α單克隆抗體干預治療后1周血漿內(nèi)毒素水平開始明顯下降,且較同周CBDL組明顯降低(P＜0.05),之后逐漸下降,但仍顯著高于sham組(治療4周時P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 5血漿TNF-α檢測:
　　 CBDL術(shù)后1周血漿TNF-α水平即明顯升高,之后呈上升趨勢,3周時血漿TNF-α水平達高峰,4周時有所回落,5周又開始回升,但均明顯高于sham組(P＜0.05)。TNF-α單

12、克隆抗體干預治療后1周即開始明顯降低,之后繼續(xù)下降,但仍高于同周sham組(治療4周時P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 6腎組織IP3R的表達
　　 免疫組織化學結(jié)果顯示,CBDL組腎組織IP3R蛋白表達較多,可見棕褐色的陽性顆粒主要集中于腎小球系膜細胞和平滑肌細胞的胞漿內(nèi),與sham組有顯著差異(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預后IP3R蛋白表達下降,與CBDL組比較,表現(xiàn)為陽性著色變少,但均明顯高于s

13、ham組(P＜0.05)。
　　 Western blot分析在260KD的位置上出現(xiàn)雜交帶,從雜交信號強度可知,CBDL術(shù)后造模組2周腎組織IP3R蛋白表達即開始明顯增加,與sham組有明顯差異(P＜0.05)。至4周達高峰,之后又下降,并在一定范圍波動。TNF-α單克隆抗體干預治療后2周開始明顯下降,與同周CBDL組有顯著性差異(P＜0.05),之后在一定范圍波動;與sham組比較差異也較明顯(P＜0.05)。