腫瘤壞死因子α轉化酶對動脈粥樣硬化的影響及其分子機制的研究.pdf

1、背景：
　　 急性冠脈綜合征患者血循環(huán)中常出現(xiàn)炎癥因子水平的增高，而后者可增加動脈粥樣硬化病變的程度和斑塊的破裂。炎癥標記物C反應蛋白(CRP)是臨床應用最廣泛的心血管事件生物標記物。研究證實，動脈粥樣硬化斑塊中存在CRP的表達，而且CRP可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達和釋放加速動脈粥樣硬化疾病的進展。CRP可刺激內(nèi)皮細胞表達附分子，促進血小板、單核細胞和T淋巴細胞黏附于內(nèi)皮細胞，最終導致血管內(nèi)皮功能的異常。
　　 凝集素樣

2、氧化低密度脂蛋白受體1(LOX-1)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，它可通過攝取氧化低密度脂蛋白而促使血管內(nèi)皮功能的異常。LOX-1表達在內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞的表面，其膜外區(qū)部分可被蛋白酶裂解成游離狀態(tài)(sLOX-1)。臨床研究證實血循環(huán)中sLOX-1水平與冠心病及炎癥的嚴重程度密切相關，可被用作心血管事件的分子生物學標記物。在易損動脈粥樣硬化斑塊中，LOX-1主要表達于巨噬細胞表面上且能夠誘導其凋亡、還可被巨噬細胞上調(diào)的蛋白酶裂解為s

3、LOX-1。此外，在斑塊破裂及血栓形成的過程中，上調(diào)的凝血酶等還可增加血小板表達LOX-1和釋放sLOX-1。急性冠脈綜合征患者血清中sLOX-1的水平與患者尿液中異前列烷的含量呈正相關、與過氧化物歧化酶的含量呈負相關，提示血清中sLOX-1的水平與血管壁的氧化應激狀態(tài)密切相關。血循環(huán)中CRP的濃度與sLOX-1的水平呈正相關、尤其在TNF-α存在的狀態(tài)下。CRP能否促使細胞釋放sLOX-1尚不明確。
　　 腫瘤壞死因子α轉化酶

4、(TACE，ADAM17)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在裂解和釋放膜結合性炎癥因子成為游離狀態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。TACE合成后以酶原的形式存在，可被有絲分裂原蛋白激酶和活性氧簇等氧化修飾其胞漿區(qū)氨基酸基團后活化。有研究報道CRP在巨噬細胞中可以通過活化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPHoxidase)增加活性氧簇和脂蛋白脂酶的表達。但尚不清楚TACE是否參與了sLOX-1的釋放過程。
　　 目的：
　　 (1)

5、探討CRP能否促使活化巨噬細胞釋放sLOX-1。
　　 (2)探討TACE是否參與了sLOX-1的釋放。
　　 (3)探討CRP刺激sLOX-1的釋放過程是否通過TACE來實現(xiàn)的。
　　 材料與方法：
　　 1.材料:胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、RPMI1640和Opti-MEM購買于LifeTechnologies公司。LOX-1ELISA試劑盒和重組人C反應蛋白購買于R&D公司。蛋白提取試劑盒

6、購買于Millipore公司或Biovision公司。
　　 2.細胞培養(yǎng)和刺激
　　 THP-1細胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。2×106/1ml單核細胞在100nMPMA過夜刺激后分化為巨噬細胞，繼續(xù)在無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中給予轉化的巨噬細胞5ng/mlTNF-α刺激12小時，然后隨機分為對照組和CRP刺激組。CRP刺激組的巨噬細胞在接受CRP刺激前48小時給予不

7、同的siRNA（TACEsiRNA、p47phoxsiRNA、CD32siRNA或CD64siRNA）;而在CRP刺激前1小時給予乙酰半胱氨酸(10mM)、香莢蘭乙酮(10Mm)、腫瘤壞死因子α轉化酶抑制劑-1(100μM)、苯甲磺酰氟(3mM)等刺激因素。為證實CRP的特異性作用，使用硫酸鹽粘多菌素B(10μg/ml)進行阻斷實驗，使用煮沸過的CRP(25μg/ml)進行替代實驗。
　　 來源于外周血單核細胞的巨噬細胞的誘導采

8、用以下兩種方法:分離的單核細胞培養(yǎng)于含20％自體血清的培養(yǎng)基中4-7天使其自行分化;或給予分離的單核細胞100nMPMA過夜刺激誘導其分化。細胞上清液保存于-80℃
　　 3.體內(nèi)實驗
　　 雄性新西蘭大白兔接受球囊損傷腹主動脈內(nèi)皮后給予高膽固醇飼料喂養(yǎng)12周，建立動脈粥樣硬化易損斑塊模型（10周末斑塊內(nèi)注射攜帶人野生型P53基因的腺病毒）。造模結束后，將它們隨機分為A組(n=10)和B組(n=10)。A組給予靜脈注射3

9、mg/kg重組人C反應蛋白，而B組給予靜脈注射等量生理鹽水。6小時后留取血樣。采用高敏感性比濁法測定血中重組人C反應蛋白的濃度。本實驗嚴格遵守中華人民衛(wèi)生部動物使用管理條例(documentation55，2001)和山東大學動物管理規(guī)定。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附法檢測
　　 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液或血清中sLOX-1的含量。上清液中sLOX-1的濃度取自于2×106/1ml濃度的細胞。
　　 5.RNA干

10、擾
　　 進行RNA干擾前使用Opti-MEM清洗和孵育巨噬細胞2小時后分別添加TACEsiRNA(200nM)、P47siRNA(100nM)、CD32siRNA(100nM)、CD64siRNA(100nM)orcontrolsiRNA(200/100nM)等，孵育12小時后更換為含10％胎牛血清/20％自體血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時后再換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時。
　　 6.細胞內(nèi)活性氧簇的測定
　　

11、 細胞內(nèi)活性氧簇采用活性氧指示劑DCF-DA檢測。細胞經(jīng)腫瘤壞死因子α(TNF-α，5ng/ml)刺激12小時后，與不同的刺激因素孵育相應的時間(CD32抗體(3μg/ml)、NAC(10mM)、Apo(10mM)1小時，或siRNA48小時）后再經(jīng)C反應蛋白(25μg/ml)刺激10分鐘至1小時，刺激結束后立即加入DCF-DA10分鐘。使用VarioskanFlash酶標儀在498nm/520nm波長下測定各孔中的熒光密度值。

12、　　 7.測定腫瘤壞死因子α轉化酶的活性
　　 使用Sensolyte520(R)TACEactivity試劑盒測定細胞裂解物中TACE的活性。將巨噬細胞收集到測定緩沖液中后，4℃條件下孵育10分鐘，4℃2500g條件下離心10分鐘后收集上清。含目的蛋白的上清液同TACE底物在37℃條件下孵育30分鐘后，使用VarioskanFlash定量酶標儀在490nm/520nm處測定各孔中的熒光密度值的變化。
　　 8.免疫蛋

13、白印跡分析
　　 按試劑盒說明書提取胞漿蛋白、胞膜蛋白和總蛋白。免疫印跡分析蛋白的表達水平，檢測指標包括LOX-1(1∶250，R&DSystems)、TACE(1∶200，Abcam)、phosphorylatedp47phox(1∶200,SydLabs)、CD32(1∶200,SantaCruz)、CD64(1∶200,SantaCruz)、Gas(1∶400,SantaCruz)和β-actin(1∶1000,Santa

14、CruzBiotechnology)。通過增強的化學發(fā)光法檢測抗原抗體復合物，使用β-actin作為對照。圖像分析儀AlphaImager2200檢測各蛋白的光密度值。
　　 9.實時多聚酶鏈反應
　　 使用TRIzolReagent試劑盒提取巨噬細胞中的總RNA，并使用DNase去除可能污染的基因組DNA。使用PrimeScriptTMReverseTranscriptase試劑盒按照說明書從500ngRNA中合成cD

15、NA。溶解曲線證實產(chǎn)物中不存在二聚體。使用LightCyclerSoftware4.0(Roche)軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用2-ΔΔCT的方法分析各基因相對表達量。
　　 10.統(tǒng)計學分析
　　 所有實驗至少重復3次。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差。數(shù)據(jù)分析使用單因素方差分析和Newman-Keulsposthoc檢驗或非配對Student'st檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.C反應蛋白促使T

16、NF-a活化的巨噬細胞釋放游離狀態(tài)的凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(sLOX-1)
　　 巨噬細胞中LOX-1蛋白基礎表達水平較低，經(jīng)TNF-a(5ng/ml)活化12小時后LOX-1蛋白的表達水平顯著增加(P＜0.01)。CRP(2.5～25μg/ml)劑量依賴性地促使活化的巨噬細胞釋放sLOX-1，且CRP發(fā)揮作用的最低有效濃度為10μg/ml。煮沸過的CRP不能促使活化的巨噬細胞釋放sLOX-1、而硫酸鹽粘多菌素B對于CR

17、P促使活化的巨噬細胞產(chǎn)生sLOX-1的效應無明顯作用。CRP(25μg/ml)可導致膜結合狀態(tài)LOX-1的水平呈時間依賴性下降，但對胞漿內(nèi)LOX-1蛋白水平無明顯影響。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF(3mM)可減弱CRP對活化的巨噬細胞產(chǎn)生sLOX-1的作用。CRP(25μg/ml)刺激6小時后對活化的巨噬細胞中總LOX-1蛋白水平無影響。
　　 2.TACE介導了CRP所致的活化巨噬細胞釋放sLOX-1的過程
　　 TAC

18、E抑制劑TAPI-1（100μM）和TACE小分子干擾RNA(TACEsiRNA，200nM)可以有效地減少CRP所致的sLOX-1的釋放。CRP在5小時內(nèi)可呈時間依賴性地增加TACE活性達47.5％，但不能增加TACE蛋白的表達水平。CRP上調(diào)TACE活性的作用可被TAPI-1抑制。因此，TACE很可能介導了CRP所致的活化巨噬細胞釋放sLOX-1的過程，然而，TACEsiRNA對LOX-1基因表達沒有影響。
　　 3.還原型

19、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶產(chǎn)生的活性氧簇參與CRP所致的活化巨噬細胞解離sLOX-1的過程
　　 CRP(25μg/ml)可增加活化巨噬細胞中活性氧簇的產(chǎn)生且在40分鐘時達到高峰?；钚匝醮厍宄齽㎞AC(10mM)可顯著降低CRP（25μg/ml）對活化巨噬細胞產(chǎn)生sLOX-1的作用。NADPH氧化酶抑制劑Apo(10mM)可顯著降低活性氧簇的產(chǎn)生和sLOX-1的釋放。NAC(10mM)和Apo(10mM)不能影

20、響基礎狀態(tài)巨噬細胞活性氧簇的產(chǎn)生。
　　 CRP（25μg/ml）促使活化的巨噬細胞時間依賴性地增加胞漿p47phox亞基的磷酸化和向胞膜的遷移，且在20分鐘達到高峰。P47siRNA可以成功地下調(diào)P47蛋白的表達水平，且能有效地降低CRP(25μg/ml)對活化巨噬細胞釋放sLOX-1的刺激作用。NAC(10mM)，Apo(10mM)和P47siRNA都可有效地降低TACE活性的增加。P47siRNA在6小時內(nèi)對活化巨噬細胞L

21、OX-1蛋白的表達水平?jīng)]有影響、但可減弱LOX-1基因的表達水平。
　　 4.Ⅱ型Fcγ受體介導CRP刺激巨噬細胞釋放sLOX-1的過程
　　 抗CD32抗體(3μg/ml)或CD32siRNA(100Nm)能有效的降低CRP刺激sLOX-1的釋放作用，而抗CD64抗體(3μg/ml)或CD64siRNA(100nM)的作用不明顯?？笴D32抗體(3μg/ml)或CD32siRNA(100nM)能降低活性氧簇的產(chǎn)生、TA

22、CE活化、p47phox亞基的磷酸化及膜轉移?？笴D32抗體（3μg/ml）、CD32siRNA、抗CD64抗體(3μg/ml)或CD64siRNA(100nM)都能減少LOX-1基因的表達水平、但6小時內(nèi)對LOX-1蛋白總量的表達無明顯影響。
　　 5.CRP促進急性冠脈綜合征患者外周血巨噬細胞釋放sLOX-1
　　 CRP能夠增加急性冠脈綜合征外周血來源巨噬細胞釋放sLOX-1的作用;抗CD32抗體(3μg/ml)、

23、NAC(10mM),Apo(10mM)、P47siRNA(100nM)、TAPI-1(100μM)或TACEsiRNA（200nM）都可降低CRP對急性冠脈綜合征患者巨噬細胞釋放sLOX-1的刺激作用。CRP對正常人外周血巨噬細胞釋放sLOX-1的作用不明顯。根據(jù)以上實驗結果，我們推斷信號通路FcγR(II)-NADPHoxidase(p47phox)-ROS-TACE對于CRP刺激巨噬細胞中釋放sLOX-1的過程中發(fā)揮主要作用。

24、>　　 6.CRP上調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化兔體內(nèi)sLOX-1的水平
　　 耳緣靜脈注射重組人CRP6小時后，A組血清中CRP的水平明顯高于B組中的水平（16±4mg/mlvs.μndetectable，P＜0.001），而且A組血清中sLOX-1的水平為B組中sLOX-1的水平的1.68倍:A組為64.3pg/ml（四分之一中位數(shù)為59.9-70.7pg/ml）而B組為39.1pg/ml(34.4-52.0pg/ml)(P＜0.01