新型選擇性腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶抑制劑的HPLC篩選方法的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶(TACE或ADAM17)屬于含鋅金屬蛋白酶家族。目前大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TACE具有重要的生理和病理作用，其功能涉及到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、誘發(fā)炎癥性腸病以及神經(jīng)性疾病等。TACE能催化水解人體內(nèi)的跨膜型腫瘤壞死因子-α(pro-TNF-α)轉(zhuǎn)化為可溶性的sTNF-α；誘發(fā)炎癥性疾病。因此，TACE成為治療炎癥性疾病的新靶標(biāo)。 人工合成的小分子抑制劑通過抑制TACE活性，進(jìn)而控制炎癥時(shí)人體內(nèi)過高的sTNF-α水平

2、，因此，尋找這些小分子抑制劑變的尤為重要，而建立有效評(píng)價(jià)酶抑制劑活性的方法是篩選這些小分子抑制劑的關(guān)鍵。本文就致力于建立評(píng)價(jià)TACE抑制劑的活性的方法。具體研究?jī)?nèi)容如下： 1.采用HPLC法評(píng)價(jià)TACE抑制劑活性。依據(jù)底物(12肽)的結(jié)構(gòu)，合成了一種新化合物：DL-α-氨基丙酸- Dpa，作為定量分析的內(nèi)標(biāo)物。對(duì)酶濃度、TACE酶促反應(yīng)時(shí)間、流動(dòng)相等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳測(cè)試條件，建立了使用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定TACE活性的HP

3、LC法；其線性范圍為10～400μmol/L，檢出限(LOD)為0.1μmol/L。然后，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用此法測(cè)定抑制劑GM6001抑制TACE的半數(shù)抑制濃度IC50值。最后，用此新方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品，其日內(nèi)和日間的RSD都分別小于5％和10％；回收率在85％～115％間。 2.HPLC法評(píng)價(jià)MMPs抑制劑活性。為了滿足選擇性TACE抑制劑篩選的需要，還必須要建立評(píng)價(jià)MMPs抑制劑的方法。本實(shí)驗(yàn)以MMP-9作為MMPs家族的代