肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A RNA干擾對動脈粥樣硬化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A RNA干擾促進(jìn)小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的實驗研究
　　研究背景：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一組血管病中常見的一種，是指動脈變硬，斑塊形成，不穩(wěn)定斑塊對機(jī)體的危害比穩(wěn)定斑塊大，纖維帽薄，受到外力作用后容易破裂，導(dǎo)致血管內(nèi)栓塞形成，造成相應(yīng)器官缺血性壞死。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyte enhancer factor2A，MEF2A)是目前研究較多的與AS相

2、關(guān)的生物活性物質(zhì)，肌肉細(xì)胞中MEF2在血管生長發(fā)育過程中起重要作用。RNA干擾（RNA interference, RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源 mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。運(yùn)用 RNA干擾的方法來降低小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（Mouse Aorta：Normal Aortic Endothelial Cells）MEF2A的表達(dá)，觀察MEF2ARNA干擾對MEF2A表達(dá)以及對血

3、管內(nèi)皮功能的影響，為預(yù)防AS的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　觀察MEF2A RNA干擾對小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)的影響及細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-l）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達(dá)情況的變化。
　　方法：
　　根據(jù)我們的設(shè)計，建立MEF2A RNA干擾慢病毒或者陰性對照慢病毒（negative control，NC），滴度1×105 TU(tr

4、ansduction units)/ml.我們轉(zhuǎn)染NC慢病毒或者M(jìn)EF2A RNAi慢病毒載體(病毒感染復(fù)數(shù)=40)給小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，以此確定沉默效率。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定MEF2A及ICAM-l、VCAM-1和PAI-1表達(dá)情況的變化。
　　結(jié)果：
　　1.基因沉默分析顯示MEF2A-site B降低小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)最有效。MEF2A RNA干擾可明顯降低MEF2A活性及其mR

5、NA表達(dá)，且其作用呈劑量依賴性。在病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）=40時作用達(dá)平臺期。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可明顯促進(jìn)小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-l、VCAM-1和PAI-1的活性及其mRNA表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可明顯抑制小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A的表達(dá)，并促進(jìn)血管內(nèi)ICAM-l、VCAM-1和PAI-1的高表達(dá)。
　　第二部分肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A RNA干擾促

6、進(jìn)載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究
　　研究背景：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一個慢性炎癥過程，調(diào)控多種炎癥介質(zhì)基因表達(dá)的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在病灶中的表達(dá)和活化均明顯上調(diào)。病灶部位的 SMC可能在某些病毒或化學(xué)因素的刺激下發(fā)生原癌基因的突變，這種基因突變導(dǎo)致SMC獲得增生優(yōu)勢，并由此衍生成一群SMC，病灶中SMC的過度增殖看作是一種腫瘤發(fā)生現(xiàn)象，從基因/蛋白變異這一新的角

7、度去研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)理。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyte enhancer factor2A，MEF2A)是一種新發(fā)現(xiàn)的維護(hù)血管內(nèi)皮穩(wěn)定性的重要生物活性物質(zhì)，MEF2A表達(dá)水平的降低是AS形成的危險標(biāo)志，越來越多的證據(jù)表明它在AS預(yù)防和病情判斷方面具有重要意義。目前普遍認(rèn)為AS是一種炎癥性疾病，AS過程中炎癥因子表達(dá)增加。實驗證明，MEF2A與血管內(nèi)皮完整性以及血管內(nèi)致動脈粥樣硬化的炎癥因子具有相關(guān)，為判斷AS的發(fā)生發(fā)展提供新

8、的方法和途徑。在我們的研究中，通過高脂喂養(yǎng)的方法，同時運(yùn)用頸動脈縮窄性套管的方法，建立載脂蛋白 E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化動物模型，觀察抑制 MEF2A表達(dá)對炎癥因子表達(dá)的影響，同時對動脈粥樣硬化斑塊變化的影響，探討它們的作用機(jī)制，為動脈粥樣硬化的預(yù)防、診斷以及治療提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。
　　目的：
　　運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)，降低肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A的表達(dá)，特別是降低AS斑塊局

9、部的表達(dá)，通過抑制肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A表達(dá)，研究其對炎癥因子的影響進(jìn)而了解抑制肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響。
　　方法：
　　選用apoE-/-小鼠，在小鼠的左頸總動脈上安置一個縮窄性硅膠套管，通過喂養(yǎng)高脂飲食，在其頸動脈上誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊形成。正中切開小鼠頸部皮膚，小心分離皮下組織和頸部肌肉，發(fā)現(xiàn)左頸總動脈后，在頸總動脈上放置一個長3mm、內(nèi)徑0.3mm的縮窄性硅膠套管，結(jié)扎絲線固定牢固。根據(jù)實驗?zāi)康?/p>

10、，將apoE-/-小鼠隨機(jī)分為三個組：即：MEF2A RNAi組、病毒陰性對照組（NC組）和對照組。另外，建立肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A RNA干擾慢病毒或NC慢病毒載體，4周后對動脈粥樣硬化模型小鼠進(jìn)行頸動脈斑塊慢病毒轉(zhuǎn)染，用生理鹽水作為對照。8周后，對標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，分別采用HE、MASSON和油紅O染色；運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)測定小鼠血液和頸部血管斑塊局部肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A表達(dá)情況的變化以及炎癥因子表達(dá)情

11、況的變化。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒轉(zhuǎn)染4周后，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A RNAi組無論是血液MEF2A濃度還是動脈粥樣硬化斑塊MEF2A mRNA表達(dá)水平都明顯降低，與此同時，炎癥基因表達(dá)水平均明顯升高。
　　2.抑制MEF2A RNA能明顯促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成，動脈粥樣硬化斑塊面積增加、斑塊纖維帽厚度增厚、斑塊膠原含量增多。與此相反，斑塊脂質(zhì)含量變化不明顯。
　　3.實驗中，三個實驗組間脂質(zhì)含量水平均無顯著性

12、差異。抑制MEF2A RNA促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成的作用獨(dú)立于降脂作用之外。
　　結(jié)論：
　　慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可明顯促進(jìn)apoE-/-小鼠形成動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化斑塊面積增加、斑塊纖維帽厚度增厚、斑塊膠原含量增多。
　　第三部分急性冠脈綜合癥及穩(wěn)定型心絞痛患者血漿MEF-2A及炎癥相關(guān)因子水平變化的對比研究
　　1、研究背景
　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相

13、互作用而引起的多基因疾病。CHD基本病理改變是冠狀動脈粥樣硬化，AS病變形成始動因素是內(nèi)皮損傷，血液中單核細(xì)胞通過內(nèi)皮細(xì)胞間隙沉積于內(nèi)膜下，形成巨噬細(xì)胞，引起一系列血管炎性改變,脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚、血栓形成、斑塊出現(xiàn)，形成動脈粥樣硬化。本研究中，我們對其形成機(jī)制進(jìn)行了對比性研究。
　　目的：
　　檢測急性冠脈綜合癥（ACS）患者、穩(wěn)定型心絞痛（SAP）患者和健康對照組血清 MEF-2A及 ICAM-1、VCAM-1、PAI-

14、1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平的變化，觀察MEF-2A與ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a變化與冠狀動脈病變程度之間的關(guān)系。
　　方法：ELISA法檢測穩(wěn)定型心絞痛、ACS患者及健康對照組血液MEF2A及ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平的變化，分析變化產(chǎn)生的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.ACS組患者血液MEF2A水平與S

15、AP組和對照組相比明顯降低；
　　2.ACS組患者血液ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平與SAP組和對照組相比明顯升高；
　　3.血液 MEF2A、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平在單只血管，雙支血管及三支血管病變組患者間無顯著性差異；
　　4.在ACS組和SAP組中MEF2A水平與ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-