維生素K2調(diào)控大鼠肝卵圓細(xì)胞SXR表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立一種具有SXR穩(wěn)定生物學(xué)特性的大鼠肝SXR基因Nr1i2表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究SXR活化后肝細(xì)胞的生物學(xué)特性提供性的技術(shù)方法。明確維生素K2對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞SXR的調(diào)控作用，以及SXR與matrilin-2之間相互關(guān)系，探討維生素K2促進(jìn)HOC介導(dǎo)的肝再生造模大鼠施行部分肝切除術(shù)后肝再生和肝功能恢復(fù)的機(jī)制。為進(jìn)一步闡明ECM在維持正常的肝臟結(jié)構(gòu)、促進(jìn)肝再生的作用及機(jī)制和臨床防治肝功能損害或衰竭、促進(jìn)肝再生的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)

2、。
　　 方法：⑴提取大鼠肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，用作PCR擴(kuò)增模板；⑵將制備的cDNA為擴(kuò)增模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增至Nr1i2編碼框區(qū)，并進(jìn)行SXR基因序列測(cè)序檢測(cè)；⑶將Nr1i2片段亞克隆至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，對(duì)pcDNA3.1(+)-Nr1i2真核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定；⑷篩選出pcDNA3.1(+)-Nr1i2載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，細(xì)胞培養(yǎng)48h后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)目的基因SX

3、R的mRNA表達(dá)，72h后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)SXR的蛋白表達(dá)。⑸選取大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344系體外培養(yǎng)，通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)WB-F344細(xì)胞SXR與matrilin-2蛋白表達(dá)；⑹分別用維生素K2和萊菔硫烷對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，運(yùn)用QPCR檢測(cè)大鼠肝卵圓細(xì)胞各處理組中SXR基因和Matrilin-2基因變化情況；⑺分析肝卵圓細(xì)胞SXR與其內(nèi)matrilin-2的表達(dá)相互關(guān)系。
　　

4、結(jié)果：①正確調(diào)取SXR(Nri12)編碼區(qū):用大鼠肝cDNA模板PCR擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)在2kb和1kb之間有單一條帶，且大小更靠近于1kb，這與SXR實(shí)際擴(kuò)增大小1318bp左右相符。繼而進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果行BLAST后發(fā)現(xiàn)其與SXR序列一致，提示SXR目的基因已成功擴(kuò)增。②成功克隆SXR至真核表達(dá)載體:質(zhì)粒行雙酶切后電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)有與SXR大小一致的條帶切出（見(jiàn)圖2）。將此克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)得序列與SXR序列一致，繼續(xù)將所克

5、隆片段測(cè)序，序列拼接后與NCBI上公布的SXR序列進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示所克隆片段序列與公布的SXR序列完全一致，說(shuō)明基因SXRCDS已成功克隆入至真核表達(dá)載體pcDNA3.1+中，可以用于后續(xù)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。③SXR表達(dá)載體成功實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá):將構(gòu)建好的SXR過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞系中，48h收集細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR，72h后Western Blot檢測(cè)。結(jié)果顯不SXR的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加。HEK-293細(xì)胞系、PC

6、DNA-3.1+、PCDNA-3.1+-NR1I2中SXR的RT-PCR結(jié)果分別為（1.00±0.09）、（4.88±0.94）、（473274.04±28784.24），后者分別與前兩者比較，均有p＜0.01。④經(jīng)過(guò)Western blot對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的工具細(xì)胞293細(xì)胞、U251細(xì)胞、hela細(xì)胞和WB細(xì)胞中SXR、Matrilin-2本底含量的檢測(cè)。結(jié)果顯示在293細(xì)胞、U251細(xì)胞、hela細(xì)胞和WB細(xì)胞中均能在50 kDa處檢

7、測(cè)出SXR表達(dá)，在107 kDa處檢測(cè)出Matrilin-2的表達(dá);對(duì)Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析，WB細(xì)胞分別與293細(xì)胞、U251細(xì)胞、hela細(xì)胞進(jìn)行比較均得出p＜0.05，說(shuō)明SXR、Matrilin-2在不同細(xì)胞的表達(dá)存在差異性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤WB細(xì)胞中SXRmRNA(Nr(1)i2)表達(dá)量:萊菔硫烷干預(yù)組SXRmRNA表達(dá)量最低，維生素K2干預(yù)組表達(dá)量最高，空白對(duì)照組位于兩者之間，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、＜0.01)。 WB細(xì)胞中matrilin-2mRNA(Matn2)表達(dá)量:萊菔硫烷干預(yù)組表達(dá)量最低，維生素K2干預(yù)組表達(dá)量最高，空白對(duì)照組位于兩者之間，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。⑥通過(guò)SXR激動(dòng)劑維生素K2與抑制劑萊菔硫烷分別對(duì)WB細(xì)胞干預(yù)，WB細(xì)胞SXRmRNA(Nrli2)與matrilin-2mRNA(Matn2)表達(dá)關(guān)系R的平方=0.8908，兩者呈正相關(guān)性(P＜0.01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在WB細(xì)胞內(nèi)存在可以通過(guò)

9、SXR調(diào)控matrirlin-2表達(dá)的關(guān)系。
　　 結(jié)論：⑴成功建立一種具有SXR穩(wěn)定生物學(xué)特性的大鼠肝SXR基因Nr1i2表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究SXR活化后肝細(xì)胞的生物學(xué)特性提供性的技術(shù)方法;⑵證實(shí)了大鼠肝HOC本身具有SXR受體和Matrilin-2;⑶SXR對(duì)matrilin-2表達(dá)起著上調(diào)作用，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈正相關(guān)的關(guān)系;⑷維生素K2作為一種SXR的激活劑，對(duì)SXR起著調(diào)控作用;⑸維生素K2促進(jìn)大鼠卵圓細(xì)胞增殖介導(dǎo)的肝