骨髓間充質(zhì)細胞聯(lián)合維生素K2對大鼠肝癌HepG2細胞抑制作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的:研究骨髓間充質(zhì)細胞(MSCs),與維生素K2(Vit K2)單獨及聯(lián)合應用對肝癌HepG2細胞系的作用及其機制,為MSCs和VitK2應用于肝癌治療的可能性提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外通過全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)和擴增大鼠MSCs,倒置顯微鏡下觀察記錄細胞形態(tài)及生長特征,采用流式細胞儀(FCM)檢測細胞表面標志CD29、CD34、CD45、CD90的表達,確認其分子表型。
　　 2.

2、體外培養(yǎng)大鼠肝癌HepG2細胞系,使其處于對數(shù)生長期,并予以擴增達到實驗數(shù)目。實驗分四組:A組:單純加MSCs,終濃度為0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml3個濃度;B組:單純加VitK2,終濃度為10μmol/ml、20μmol/ml、40μmol/ml3個濃度;C組:A組與B組分別組合,組合后形成低中高三個聯(lián)合濃度;D組:陰性對照組,只有肝癌HepG2細胞,未加任何試劑,細胞定期給予換液。每組不同濃度分別設4個復

3、孔,每孔終體積150μl,于37℃、5％濃度CO2下培養(yǎng);培養(yǎng)液每24h更換一次。倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)學變化,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法測定各組細胞的生長抑制率,FCM檢測各組細胞凋亡率,并分析細胞周期變化,RT-PCR檢測各組細胞中NF-κBmRNA表達情況。
　　 結果:
　　 1.倒置顯微鏡觀察記錄細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),MSCs隨著培養(yǎng)天數(shù)變化呈現(xiàn)橢圓形、梭狀或多邊形等不同形態(tài),增殖迅速;消化傳代的細胞增殖更加迅

4、速,呈典型的MSCs形態(tài),為均一的長梭形,融合后呈漩渦狀或紡錘狀。
　　 2.采用FCM對第三代MSCs進行表型鑒定,發(fā)現(xiàn)高表達CD29、CD90,低表達CD34、CD45。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察:陰性對照組肝癌HepG2細胞大小形態(tài)不一致,隨著時間延長能疊加成堆生長,喪失接觸抑制和密度抑制;但實驗組細胞呈圓形,核漿比例減少,呈單層生長,在長至匯合后呈現(xiàn)接觸抑制和密度抑制,細胞數(shù)量隨著時間和藥物濃度的增加而下降,聯(lián)

5、合處理組效果更明顯,細胞稀少。
　　 4.MTT比色法顯示不同濃度的MSCs(0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml)和VitK2(10μmol/ml、20μmol/ml、40μmol/ml)均能抑制肝癌HepG2細胞的生長。隨著MSCs和VitK2濃度的增加,抑制作用逐漸增強,呈現(xiàn)明顯的劑量-時間效應。同一作用時間不同藥物濃度組間的細胞生長抑制率差異有顯著性意義;同一濃度組不同作用時間之間的細胞生長抑制率差異

6、亦有顯著性意義;聯(lián)合用藥組比單獨用藥組具有更高的抑制率,其差異亦有顯著性意義。
　　 5.FCM檢測大鼠肝癌HepG2細胞凋亡率結果顯示,隨著MSCs和(或)VitK2濃度的增加和作用時間的延長,細胞凋亡率逐漸升高,亦呈現(xiàn)明顯的劑量-時間效應。相同藥物各單用組間比較差異有顯著性意義。聯(lián)合用藥組比單獨用藥組具有更高的凋亡率,其差異亦有顯著性意義。
　　 6.FCM檢測MSCs和(或)VitK2對肝癌HepG2細胞周期影響結

7、果顯示:各實驗組細胞周期變化基本相同,均表現(xiàn)為G0/G1期細胞減少,S期細胞增多,G2/M期細胞無明顯變化,聯(lián)合用藥組更明顯,與單用實驗組比較差異具有統(tǒng)計學意義。各組中細胞周期隨著濃度的增加和時間的延長而作用更明顯。
　　 7.各組細胞培養(yǎng)72h后應用RT-PCR.檢測細胞NF-κmRNA的表達,發(fā)現(xiàn)對照組表達較高,實驗組隨著MSCs和(或)VitK2濃度的升高,細胞NF-κB mRNA的表達量逐漸降低。單用組細胞NF-κB m