大鼠Gsk3β基因過表達及Gsk3β抑制劑SB-216763對肝卵圓細胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 1.研究Gsk3β基因過表達通過Wnt信號通路對大鼠肝卵圓細胞增殖的影響及其調(diào)控機制;
　　 2.研究Gsk3β抑制劑SB-216763通過Wnt信號通路對大鼠肝卵圓細胞增殖的影響及其調(diào)控機制。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建并鑒定大鼠Gsk3β基因過表達慢病毒載體PGC-FU-Gsk3β-EGFP，檢測該慢病毒的轉(zhuǎn)染效率，并篩選其處理肝卵圓細胞的最佳感染復數(shù)(MOI);
　　 2.配

2、制不同濃度的Gsk3β抑制劑SB-216763，并篩選抑制劑SB-216763處理肝卵圓細胞的濃度梯度;
　　 3.實驗分組:將大鼠肝卵圓細胞WB-F344分為空白慢病毒載體對照組、Gsk3β基因過表達慢病毒載體組，以及DMSO對照組和Gsk3β抑制劑組，其中抑制劑組SB-216763設立4個濃度梯度，即0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L;
　　 4.將大鼠Gsk3β基因過表達慢病毒載體和空白慢病毒載體與大鼠肝

3、卵圓細胞系WB-F344共培養(yǎng)，在相差倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下分別觀察兩組細胞形態(tài)及其生長狀態(tài)，以及慢病毒感染后細胞的熒光表達情況;
　　 5.將各個濃度梯度的Gsk3β抑制劑SB-216763(即濃度分別為O、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L)與大鼠肝卵圓細胞系WB-F344共培養(yǎng)，在相差倒置顯微鏡下觀察各個抑制劑組細胞形態(tài)及其生長狀態(tài);
　　 6.采用細胞活性計數(shù)試劑盒（CCK-8試劑盒）檢測Gsk3β基

4、因過表達慢病毒載體和空白慢病毒載體及各個濃度梯度的Gsk3β抑制劑SB-216763對大鼠肝卵圓細胞系WB-F344增殖的影響，Annexin V-FITC/PI流式凋亡試劑盒檢測Gsk3β基因過表達慢病毒載體組和空白慢病毒載體對照組中肝卵圓細胞的凋亡情況，Western blot免疫蛋白印跡技術(shù)檢測各組細胞Wnt信號通路中關(guān)鍵蛋白Gsk3β、β-catenin及cyclin D1的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成

5、功構(gòu)建并正確鑒定出大鼠Gsk3β基因過表達慢病毒載體PGC-FU-Gsk3β-EGFP，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)該慢病毒載體可高效穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細胞系WB-F344，而且發(fā)現(xiàn)它的最佳感染復數(shù)為MOI=25。
　　 2.肝卵圓細胞經(jīng)Gsk3β基因過表達慢病毒載體和空白慢病毒載體處理后，可以發(fā)現(xiàn)Gsk3β基因過表達慢病毒載體組細胞數(shù)目較少，狀態(tài)不佳，老化明顯，且可見大量綠色熒光出現(xiàn)。CCK-8實驗及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示Gsk3β基因過表達慢病

6、毒載體組細胞增殖減慢(t=7.178，P＜0.01)，凋亡顯著。Western blot實驗結(jié)果顯示過表達組細胞的Gsk3β蛋白呈現(xiàn)高表達趨勢，β-catenin及cyclin D1蛋白的表達強度減弱。
　　 3.肝卵圓細胞經(jīng)抑制劑SB-216763處理后，可以發(fā)現(xiàn)各Gsk3β抑制劑組細胞分裂增殖旺盛，狀態(tài)良好，幾乎未見明顯死亡細胞，而且各組的細胞數(shù)目隨著抑制劑SB-216763濃度的升高而增多，CCK-8實驗結(jié)果顯示各Gsk3