GSK3β過(guò)表達(dá)對(duì)阿姆西汀、小補(bǔ)心湯總黃酮抗抑郁作用的影響.pdf

1、目的:
　　軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所神經(jīng)精神藥理研究室長(zhǎng)期從事抗抑郁藥物研發(fā)及相關(guān)基礎(chǔ)研究。前期以度洛西汀(duloxetine，DLX)為先導(dǎo)化合物，合成篩選出新型化合物鹽酸阿姆西汀(ammoxetine，AMX)，前期已經(jīng)證實(shí)其具有顯著的抗抑郁活性，并且肝毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于度洛西汀。小補(bǔ)心湯(XBXT)屬于傳統(tǒng)古方中藥，最早見(jiàn)于南北朝時(shí)期的敦煌莫高窟遺書(shū)《輔行決臟腑用藥法要》，由代赭石、旋復(fù)花、竹葉、淡豆豉四味中藥組成。該研究室

2、首次發(fā)現(xiàn)XBXT及其總黃酮提取物(XBXT-2)在多種模型上表現(xiàn)出明確的抗抑郁活性。
　　近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)及其相關(guān)信號(hào)通路與抑郁癥的發(fā)生和治療密切相關(guān)，GSK3β失活（磷酸化增加）會(huì)產(chǎn)生抗抑郁作用，本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMX和XBXT-2均可以增加GSK3β磷酸化水平并激活其相關(guān)信號(hào)通路。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使小鼠腦組織海馬

3、部位GSK3β過(guò)表達(dá)或者持續(xù)激活，進(jìn)一步探究AMX和XBXT-2對(duì)GSK3β相關(guān)信號(hào)通路的影響，試圖闡明GSK3β及其相關(guān)信號(hào)通路是否是AMX和XBXT-2抗抑郁作用發(fā)揮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　方法:
　　本研究采用以腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)為載體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建包裝有GSK3β(WT)野生型和GSK3β(S9A)突變型基因的腺相關(guān)病毒，通過(guò)海馬立體定位微注射的方式，使GSK3β在小鼠

4、海馬過(guò)表達(dá)或者持續(xù)激活，通過(guò)一系列行為學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討GSK3β是否是AMX、XBXT-2發(fā)揮抗抑郁、抗焦慮作用的關(guān)鍵分子靶標(biāo)。
　?。ㄒ唬┖ｑRGSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活對(duì)AMX抗抑郁作用的影響:
　　進(jìn)行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活，通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，研究海馬GSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活對(duì)阿姆西汀抗抑郁作用的影響;并通過(guò)蛋白免疫印跡法(western blot)檢測(cè)海馬腦區(qū)PI-3K

5、/Akt/GSK3β信號(hào)通路的功能蛋白及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)含量的變化。
　?。ǘ┖ｑRGSK3β持續(xù)激活對(duì)XBXT-2抗抑郁作用的影響:
　　進(jìn)行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬持續(xù)激活，通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、爬梯實(shí)驗(yàn)研究海馬GSK3β持續(xù)激活對(duì)小補(bǔ)心湯總黃酮抗抑郁、抗焦慮作用的影響;進(jìn)行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬持續(xù)激活，在獲得性無(wú)助模型上探究GSK3β的失抑制是否會(huì)增

6、加抑郁的易感性;并通過(guò)western bolt方法檢測(cè)PI-3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路各蛋白以及BDNF含量的變化，探討GSK3β失抑制增加抑郁易感性的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　（一）AMX單次給藥(2.5mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間，該行為效應(yīng)能夠被小鼠海馬GSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活所取消;AMX單次給藥(5 mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，該行為效應(yīng)能夠被小鼠海馬GS

7、K3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活所取消;無(wú)論是藥物還是海馬GSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活均對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)沒(méi)有影響;western blot結(jié)果顯示AMX可以上調(diào)p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF的蛋白表達(dá)水平，但是該作用被GSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活所取消。
　?。ǘBXT-2長(zhǎng)期給藥(100mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，該行為效應(yīng)均能夠被海馬GSK3β持續(xù)激活所取消;XBXT-2長(zhǎng)期

8、給藥（100mg/kg），可以顯著縮短陰性病毒組小鼠在爬梯實(shí)驗(yàn)中的站立次數(shù)，該行為效應(yīng)能夠被海馬GSK3β持續(xù)激活取消;XBXT-2長(zhǎng)期給藥(100mg/kg)，可以顯著增加陰性病毒組小鼠在高架實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分比和在開(kāi)臂停留時(shí)間的百分比，該行為效應(yīng)不僅被海馬GSK3β持續(xù)激活所取消，并且海馬GSK3β持續(xù)激活顯著降低了小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)的百分比;在獲得性無(wú)助模型中，GSK3β持續(xù)激活小鼠逃避失敗次數(shù)顯著增加，糖水偏嗜度顯著下降，并

9、且XBXT-2的抗抑郁行為效應(yīng)被完全取消;western blot結(jié)果顯示在獲得性無(wú)助造模之后，GSK3β持續(xù)激活小鼠的p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF表達(dá)水平同陰性病毒組相比均顯著下降，并且XBXT-2對(duì)這些蛋白的上調(diào)作用亦被完全取消。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)本課題實(shí)驗(yàn)研究可得到如下結(jié)論:(1)在懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，海馬GSK3β過(guò)表達(dá)或持續(xù)激活不能引起小鼠抑郁樣表現(xiàn)，但是能夠取消AMX和XBXT-2

10、的抗抑郁行為效應(yīng);(2)在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和爬梯實(shí)驗(yàn)上，GSK3β持續(xù)激活取消了XBXT-2的抗焦慮作用，并且在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生致焦慮樣行為表現(xiàn);(3)在獲得性無(wú)助模型中，GSK3β持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激易感性增加;(4) GSK3β過(guò)表達(dá)/持續(xù)激活對(duì)p-Akt、p-CREB和BDNF的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著影響，但是能夠取消AMX對(duì)這些蛋白含量的上調(diào)作用;(5) GSK3β持續(xù)激活在獲得性無(wú)助模型之后，能夠顯著下調(diào)p-Akt、p-CRE