豬GSK3β蛋白對Il-10、Il-12和GYS1基因表達的調(diào)控研究.pdf

1、糖原合成酶激酶3(GSK3)是一種廣泛存在于哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸類激酶，其作用的底物高達100多種，參與眾多的信號通路并在其中發(fā)揮重要的功能。在哺乳動物中GSK3存在GSK3α和GSK3β兩種亞型，它們雖然在結(jié)構(gòu)上具有非常高的同源性，但是其功能卻是不盡相同的。本研究目的在于探究豬GSK3β蛋白及其不同亞型在炎癥反應的作用以及對其直接作用底物糖原合成酶(GS)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，為進一步研究GSK3β基因在豬的抗病育種以及肌肉糖原代謝中

2、的作用提供一定的理論基礎。主要結(jié)果如下:
　　(1)用LPS誘導豬腎細胞系(PK-15)，使其產(chǎn)生炎癥反應，或用GSK3β抑制劑LiCl處理細胞，利用Western blot檢測GSK3β的磷酸化程度，進而檢測其活性變化。結(jié)果表明:LPS處理、LiCl處理以及LiCl/LPS共同處理能通過升高PK-15細胞中的GSK3β(ser9)的磷酸化程度從而降低其GSK3β蛋白的活性;
　　(2)利用ELISA技術檢測LPS刺激細胞以

3、及先用LiCl處理再用LPS誘導細胞后的細胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果表明:LPS處理極顯著增加細胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量（P＜0.01);而使用GSK3β活性抑制劑即LiCl預先處理細胞后再用LPS誘導細胞組的IL-10和IL-12表達量較空白組有顯著的增加(P＜0.05），但較LPS處理組又有顯著的降低(P＜0.05)，表明GSK3β參與了由LPS誘導的PK-15細胞對IL-10和IL-12的分泌;

4、
　　(3)利用qPCR檢測LPS誘導后GSK3β的5種亞型的mRNA的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS處理細胞能引起GSK3β基因5種亞型mRNA表達水平的變化。其中GSK3β2在15，30，60和120 min呈現(xiàn)顯著地下降(P＜0.01); GSK3β5在30，60和120 min呈現(xiàn)顯著地下降(P＜0.05); GSK3β3在15，30 min有一個短暫的顯著上升(P＜0.05)。這個結(jié)果說明，GSK3β基因5種亞型可能對由LP

5、S誘導細胞的IL-10和IL-12分泌具有不同的調(diào)節(jié)作用;
　　(4)表達GSK3β的4種亞型后，用LPS誘導細胞并用ELISA技術檢測細胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量均出現(xiàn)顯著增加(P＜0.05）。其中GSK3β1的促進作用最為強烈，GSK3β3次之，GSK3β2和GSK3β5相對最弱;
　　(5)利用qPCR檢測不同時間的IGF-1處理下的GYS1和GYS2基

6、因的表達模式。在外源添加物胰島素樣生長因子(IGF-1)的刺激下，GYS1的mRNA水平表達出現(xiàn)顯著的上調(diào)變化而GYS2的mRNA水平的表達量沒有顯著變化;進一步發(fā)現(xiàn)在細胞中過表達GSK3β后，GYS1的mRNA表達水平出現(xiàn)極顯著的下降，說明GSK3β影響GYS1的轉(zhuǎn)錄水平表達;
　　(6)用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測構(gòu)建的GYS1的啟動子片段活性以及GSK3β共轉(zhuǎn)染GYS1的5個啟動子片段后的其啟動子的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當其5個啟動子

7、片段單獨轉(zhuǎn)染后的相對熒光值較pGL3-basic有顯著的提高(P＜0.05)，其中片段+224/-350的活性顯著高于+224-/147片段和+224-/539片段(P＜0.05);而GSK3β與GYS1的5個啟動子片段共轉(zhuǎn)染后，pGL3-350/+224，pGL3-961/+224，pGL3-1488/+224這三個片段的啟動子相對熒光值顯著降低(P＜0.05)，說明在GYS1基因的-147至-350，-350到-539以及-539至