維生素D受體在高糖導(dǎo)致的小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―N）是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥和微血管病變之一，發(fā)病率在逐年攀升,其也已經(jīng)為終末期腎臟病（ERSD）的主要病因。足細(xì)胞為腎小球的臟層上皮細(xì)胞，被覆于腎小球的基底膜（GBM)之上，是腎小球濾過屏障的其中的主要構(gòu)成之一。糖尿病腎病中腎小球病理生理方面的改變除了基底膜增厚和系膜基質(zhì)的增生外，足細(xì)胞的數(shù)量和相關(guān)功能的改變在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展的過程中也起到了相當(dāng)重要的作用。因此DN蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展與足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（EM

2、T）及屏障功能損傷密不可分。維生素D受體（VDR）是核受體超家族的一員，廣泛分布于多種組織、細(xì)胞，如肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及腎小球足細(xì)胞等。維生素D（VD）-VDR信號系統(tǒng)具有調(diào)控基因表達(dá)、鈣磷代謝、細(xì)胞遷移和分化、免疫反應(yīng)等多種作用，并且這些調(diào)控作用依賴于VDR的表達(dá)水平及活性。有研究表明，VDR在長期慢性腎臟病、終末期腎臟病及長期糖尿病導(dǎo)致的微炎癥狀態(tài)的患者體內(nèi)有表達(dá)量減少的趨勢，但關(guān)于VDR與糖尿病腎病足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化之間的

3、關(guān)系的研究甚少。Wnt信號通路是介導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT的重要通路之一。我們前期的實驗結(jié)果也已證實，Wnt信號通路關(guān)鍵分子—糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和β-catenin在高糖刺激下的足細(xì)胞中表達(dá)增加，導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)增多，促進(jìn)足細(xì)胞的EMT過程，使屏障功能受損。但在高糖環(huán)境中三者如何相互影響，機制不清。帕立骨化醇（Paricalcitol）是一種 VDR激動劑，對腎臟有多個方面的保護作用。本實驗利用VDR激動劑—帕立骨化

4、醇在細(xì)胞水平研究VDR對Wnt信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)調(diào)控作用以及VDR對高糖造成的足細(xì)胞表型及功能損害的保護作用。
　　方法：⑴利用正常糖濃度條件下培養(yǎng)的足細(xì)胞檢測維生素 D受體的表達(dá)水平與足細(xì)胞表型的關(guān)系：將正常糖濃度培養(yǎng)條件下的足細(xì)胞分為以下三組：正常糖濃度組:含5.6mmol/L葡萄糖；scramble siRNA組:含5.6mmol/L葡萄糖+100pmol/LscramblesiRNA；VDRsiRNA組:5.6mmol

5、/L葡萄糖+100pmol/L VDRsiRNA。利用western blot和qRT-PCR技術(shù)在蛋白及基因水平上檢測VDR、GSK-3β、β-catenin、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白podocin、nephrin以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA、MMP9的表達(dá)水平。⑵帕立骨化醇對高糖造成的足細(xì)胞 EMT的作用：將培養(yǎng)的足細(xì)胞分為正常糖濃度組、正常糖濃度加入DMSO組、正常糖濃度加入帕立骨化醇（0.1μM）組、高糖培養(yǎng)組、高糖濃度加入DMSO組

6、、高糖培養(yǎng)加入帕立骨化醇（0.1μM）組，分別檢測細(xì)胞中VDR的表達(dá)水平、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白podocin、nephrin的表達(dá)水平，以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA、MMP9的表達(dá)水平。⑶帕立骨化醇對高糖造成的足細(xì)胞屏障功能損傷的作用：利用白蛋白流量檢測上述各處理組的單層臟層上皮細(xì)胞的屏障功能。根據(jù)一定密度（5×103），把已經(jīng)分化成熟的足細(xì)胞消化并接種于Transwell小室上層的纖維膜上，等到足細(xì)胞相互融合后，更替無血清的1640培養(yǎng)

7、基使足細(xì)胞饑餓6-8小時達(dá)到同步化，然后再按照上述實驗條件依次處理足細(xì)胞36小時，而后用已經(jīng)滅菌的PBS液洗滌細(xì)胞兩到三次，然后給Transwell小室的下部更替為1ml1640培養(yǎng)基，上部更替為0.3ml含有40mg/ml胎牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基，置于37度中1小時后，取下層培養(yǎng)液，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒來確定小室下部培養(yǎng)基的蛋白濃度，即白蛋白流量。⑷將培養(yǎng)的足細(xì)胞分為正常糖濃度組、正常糖濃度加入DMSO組、正常糖濃度加入帕

8、立骨化醇（0.1μM）組、高糖培養(yǎng)組、高糖濃度加入 DMSO組、高糖培養(yǎng)加入帕立骨化醇（0.1μM）組，分別檢測細(xì)胞中 GSK-3β、β-catenin的蛋白表達(dá)水平及活性。⑸驗證VDR是否通過GSK-3β參與足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化：正常(5.6mM）培養(yǎng)條件下的足細(xì)胞：正常對照組：培養(yǎng)基含5.6mM的葡萄糖；GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染組；scramble siRNA轉(zhuǎn)染組；帕立骨化醇組；帕立骨化醇+GSK-3βsiRNA轉(zhuǎn)染組；帕立骨化醇+sc

9、ramble siRNA轉(zhuǎn)染組，36小時后利用western blot和qRT-PCR技術(shù)在蛋白及基因水平上檢測VDR、β-catenin、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白podocin、nephrin以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA、MMP9的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①利用siRNA干擾VDR的表達(dá)后，和正常糖濃度組相比，足細(xì)胞中VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表達(dá)降低(P＜0.05)，而GSK-3β、β-catenin、α-SM

10、A、MMP9的蛋白和基因表達(dá)增加(P＜0.05)。②高糖條件下VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表達(dá)降低(P＜0.05)，而GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的蛋白和基因表達(dá)增加(P＜0.05)，經(jīng)帕立骨化醇處理后 VDR、podocin、nephrin的蛋白及基因表達(dá)增加(P＜0.05)，而GSK-3β、β-catenin、α-SMA、MMP9的蛋白和基因表達(dá)降低(P＜0.05)；③白蛋白流量檢測顯

11、示，高糖條件下足細(xì)胞白蛋白流量增加(P＜0.05)，經(jīng)帕立骨化醇處理后，足細(xì)胞白蛋白流量降低(P＜0.05)。④高糖條件下足細(xì)胞GSK-3β、β-catenin蛋白及基因表達(dá)增加(P＜0.05)，給予帕立骨化醇處理后，GSK-3β、β-catenin蛋白及基因表達(dá)減少P＜0.05。⑤利用siRNA干擾正常培養(yǎng)條件下的足細(xì)胞中GSK-3β的表達(dá)量，再加入帕立骨化醇，足細(xì)胞標(biāo)記蛋白 nephrin，podocin蛋白及基因表達(dá)增多(P＜0.