SiRNA干擾MAS基因?qū)π∈驧S-1細(xì)胞功能及增殖的影響.pdf

1、【目的】：
　　胰島微循環(huán)中胰島內(nèi)皮細(xì)胞與β細(xì)胞相互毗鄰,相互依存。內(nèi)皮細(xì)胞不但參與構(gòu)成胰島微循環(huán),為β細(xì)胞的生存提供物質(zhì)基礎(chǔ),而且還能分泌多種細(xì)胞因子,影響β細(xì)胞的功能和狀態(tài)。新近發(fā)現(xiàn)的ACE2-Ang1-7–Mas通路能拮抗經(jīng)典RAS途徑ACE-AngⅡ-AT1R通路的作用,發(fā)揮血管舒張,抗氧化應(yīng)激及改善內(nèi)皮功能等作用。在胰腺的內(nèi)分泌組織中已發(fā)現(xiàn)完整的局部RAS系統(tǒng)。MAS受體是Ang1-7的內(nèi)源性受體,其主要分布于胰島內(nèi)皮細(xì)

2、胞。為了進(jìn)一步研究胰島內(nèi)ACE2-Ang1-7–Mas路徑的功能及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用,本研究采用siRNA干擾技術(shù)沉默胰島微循環(huán)內(nèi)皮MS-1細(xì)胞的MAS基因,以觀察探究其對(duì)MS-1細(xì)胞的功能及增殖的影響。
　　【方法】:
　　化學(xué)合成針對(duì)MAS基因的3對(duì)siRNA,用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000將其轉(zhuǎn)染至小鼠胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1細(xì)胞中。應(yīng)用FCM檢測(cè)FAMsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)胞后轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時(shí)熒光

3、定量PCR檢測(cè)MASsiRNA轉(zhuǎn)染后的抑制效率,以及反映內(nèi)皮功能eNOS,ICAM-1,VCAM-1的mRNA的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)eNOS的蛋白表達(dá),cck8(cellcountingkit-8)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況,FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖指數(shù)PI的變化。
　　【結(jié)果】:
　　FCM檢測(cè)FAMsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)胞后轉(zhuǎn)染效率79.41％。與空白對(duì)照組相比,MASsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)胞后,其MAS抑制效率為7

4、8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與未轉(zhuǎn)染組相比,eNOSmRNA的表達(dá)下降了18.36%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。eNOS的蛋白水平未見(jiàn)顯著改變。ICAM-1,VCAM-1的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染組相比,其mRNA的表達(dá)有上升的趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PI檢測(cè)顯示MASsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)胞后,細(xì)胞PI明顯增加(P<0.05)。CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性,與對(duì)照組相比,MS-1細(xì)胞增殖活性增加(P<0.05)。