Ap-1基因siRNA干擾對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的影響.pdf

1、目的： 再狹窄是影響經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)遠(yuǎn)期療效的主要障礙。盡管血管成形術(shù)后的再狹窄機(jī)制目前尚不十分清楚，但有很多因素參與，包括血栓形成，平滑肌細(xì)胞增值和遷移，血管的彈性回縮，細(xì)胞外基質(zhì)堆積引起的慢性重構(gòu)。每一環(huán)節(jié)都是治療的關(guān)鍵。尸體解剖報(bào)告證明再狹窄一定程度上是內(nèi)膜增生引起的。平滑肌細(xì)胞增殖和遷移是動(dòng)脈壁損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)膜形成的主要機(jī)制。中膜的平滑肌細(xì)胞有較低的分裂活性，在動(dòng)脈壁損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的早期

2、階段，各種生長因子刺激動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，并開始增殖，引起動(dòng)脈內(nèi)膜增厚。平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變?cè)谘芗膊〉陌l(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。除生長因子的作用，平滑肌細(xì)胞增值和遷移還要求細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)分解和再塑型，平滑肌細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分包括膠原，彈力蛋白，蛋白聚糖。在血管介入治療損傷中，細(xì)胞外基質(zhì)的積聚和分解的失調(diào)是內(nèi)膜增厚的主要原因，基質(zhì)的再塑型要求蛋白水解酶的活動(dòng)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起著關(guān)鍵

3、作用。MMP—2，MMP—9活性在球囊損傷后第7天可達(dá)到高峰，與平滑肌細(xì)胞由中層向內(nèi)膜遷移的時(shí)間過程相吻合。有研究顯示，AP—1在球囊動(dòng)脈損傷中活性明顯增加。 A P—1主要由Jun和Fo s兩大類蛋白質(zhì)因子家族組成。Jun亞類中包括c—Jun、JunB、JunD；Fo s亞類中包括c—Fo s、Fo sB、F ra1、F ra2等。Jun亞類成員可以與任何AP—1家族因子結(jié)合形成同源或異源二聚體，或與另外一類含bZIP的轉(zhuǎn)錄

4、激活因子(ATF)家族形成Jun—ATF2異源二聚體；而Fo s亞類只能和Jun亞類之間形成異源二聚體。AP—1的DNA特異性識(shí)別結(jié)合序列是只能被二聚體所介導(dǎo)。大量研究顯示，AP—1同DNA親和力(或高或低)位點(diǎn)的存在，可能是某一特定基因誘導(dǎo)A P—1結(jié)合的重要機(jī)制之一。因此，我們通過AP—1 ODN或反義c—Jun或反義c—Fos來降低AP—1總的DNA結(jié)合活性抑制平滑肌細(xì)胞增生，都取得明顯效果。抑制平滑肌細(xì)胞增值的基因治療作為PTC

5、A術(shù)后減少狹窄的潛在方法?？墒牵w外用decoy ODN被核酸酶消化問題沒有解決。StealthTMRNAi克服了這一難題。 目前，RNA干擾是最近發(fā)展起來的一種快速關(guān)閉基因的新方法。指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(dsRNA)時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。由21—25個(gè)核苷酸組成的小片段干涉RNA是RNAi過程中直接起作用的分子，細(xì)胞表現(xiàn)出特定缺失的表型。RNAi對(duì)染色體

6、DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響。假設(shè)基因沉默能使AP—1復(fù)合物的活性減弱或喪失。我們?cè)O(shè)計(jì)了大鼠AP—1的siRNA，分別在c—Jun和c—Fos兩個(gè)亞基設(shè)置靶點(diǎn)，采用LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑。把AP—lsiRNA轉(zhuǎn)染入血管平滑肌細(xì)胞，通過抑制AP—1基因的表達(dá)，檢測VSMCs的增殖、遷移及去分化是否改交，血清刺激對(duì)AP—1基因沉默的VSMCs的作用有無相應(yīng)的變化。 方法： 1、采用組織

7、塊貼壁法行大鼠平滑肌細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，小鼠抗大鼠α—SM—actin單克隆抗體免疫熒光鑒定。 2、siRNAs由美國Invitregen公司設(shè)計(jì)合成3對(duì)StealthTMsiRNA，。同時(shí)合成與AP—1基因序列無關(guān)的siRNA作為陰性對(duì)照(negative control)。把特異性siRNA序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較(Blast)，與其他基因和EST序列沒有同源性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA組

8、及陽性(AP—1+A、AP—1+B和AP—1+C)siRNA組。使用LipofectamineTM2000，轉(zhuǎn)染AP—lsiRNA入平滑肌細(xì)胞。 3、用RT-PCR方法檢測AP—1及下游基因的mRNA的表達(dá)，Westernblot方法檢測c—Fos和c—Jun及AP—1下游基因的蛋白的表達(dá)，Trans—AM方法檢測AP—1活性。 4、應(yīng)用PCNA和MTT法檢測VSMCs增殖的變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；用Transwe

9、ll和刮痕實(shí)驗(yàn)方法檢測平滑肌細(xì)胞遷移情況， 5、用RT-PCR方法檢測SM-α actin的mRNA的表達(dá)，Westernblot方法檢測SM-α actin的蛋白的表達(dá)，免疫熒光共聚焦顯微鏡(Olympus FV—500)下觀察平滑肌細(xì)胞分化情況。 6、用RT-PCR方法檢測MMP—2、TIMP—2的mRNA的表達(dá)，Westernblot方法檢測MMP—2和u-PA的蛋白的表達(dá)，明膠酶譜分析MMP—2和MMP—9活性。

10、 結(jié)果： 1、陽性AP—1+B siRNA轉(zhuǎn)染后的VSMCs的AP—1mRNA和e—Jun，c—Fos表達(dá)量顯著降低，其余2個(gè)陽性轉(zhuǎn)染組的AP—1表達(dá)量與未轉(zhuǎn)染組及陰性siRNA轉(zhuǎn)染組差異不顯著，AP—1活性降低。AP—1+B siRNA的抑制效果最顯著，故選擇第AP—1+B siRNA作為陽性siRNA干預(yù)實(shí)驗(yàn)。 2、AP—1+B siRNA組的增殖活性明顯低于未轉(zhuǎn)染組和陰性siRNA干擾組。提示AP—1基因沉

11、默后VSMC增殖能明顯受到抑制，AP—1+B siRNA轉(zhuǎn)染后VSMCs的PCNA陽性染色率較未轉(zhuǎn)染組和陰性siRNA組均顯著下降(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示，AP—1+B siRNA干預(yù)后，被阻滯于G0/G1期的細(xì)胞增加，而S+G2/M期的細(xì)胞減少 3、在mRNA和蛋白表達(dá)效果上，AP—1+B siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)c—Jun、c—Fos、e—myc、bFGF、ET—1、TGF-β抑制明顯高于未轉(zhuǎn)染組及陰性siRN

12、A轉(zhuǎn)染組。 4、為驗(yàn)證AP—1基因siRNA對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白SMα—actin表達(dá)的影響，用免疫熒光染色、RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析觀察到與未轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA組相比，AP—1+B基因siRNA組的SMα—actin表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞由原來的多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，環(huán)繞排列呈明顯的管腔樣生長，細(xì)胞增殖能力下降，平滑肌特異性分化標(biāo)志蛋白SMα—actin．表達(dá)上調(diào)，說明細(xì)胞由合成表型逆轉(zhuǎn)為分化表型． 5、Tr

13、answell趨化小室和刮傷試驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常平滑肌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染AP—1基因siRNA的平滑肌細(xì)胞明顯減慢，遷移細(xì)胞數(shù)少。來轉(zhuǎn)染組和陰性siRNA組之間細(xì)胞遷移速度無變化。AP—1+B基因siRNA陽性組與未轉(zhuǎn)染組和陰性siRNA組在移行細(xì)胞數(shù)和移行距離上比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 6、用蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)AP—1基因siRNA陽性組抑制MMP—2的表達(dá)，TIMP—2mRNA變化不大。而未轉(zhuǎn)染組和陰

14、性siRNA組之間MMP—2表達(dá)變化不大。AP—1+BsiRNA陽性組與未轉(zhuǎn)染組組和陰性siRNA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。。未轉(zhuǎn)染組和陰性siRNA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AP—1+BsiRNA陽性組與未轉(zhuǎn)染組比較，AP—1基因siRNA陽性組轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋自酶MMP—2、MMP—9活性明顯降低。而陰性siRNA組和未轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞中MMP—2、MMP—9活性變化不大。 結(jié)論： 1、A