Smoothened（Smo）siRNA對(duì)結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞Smo基因表達(dá)及細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectalcancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類的健康與生命。目前認(rèn)為，結(jié)直腸癌的發(fā)生是機(jī)體內(nèi)因(結(jié)直腸癌的遺傳易感性)和外因(飲食和環(huán)境因素)共同作用的結(jié)果。大量實(shí)驗(yàn)證明結(jié)直腸癌的發(fā)生與基因改變密切相關(guān)，正常粘膜細(xì)胞在生長、分化過程中出現(xiàn)癌基因的激活、抑癌基因的失活與丟失都可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，其癌變過程可能涉及多個(gè)基因、多個(gè)位點(diǎn)的突變與丟失。通過對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因研究，不僅可

2、以進(jìn)一步明確結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)也為結(jié)直腸癌的生物治療提供新的靶向。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)很多在胚胎發(fā)育、組織分化過程中起調(diào)控作用的信號(hào)通路同樣在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用，其中包括EGFR信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Sonichedgehog信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等在動(dòng)物發(fā)育中起重要作用的信號(hào)通路，都在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了突變。“控制脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的信號(hào)通路可能與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)”這一觀點(diǎn)的提出，為腫

3、瘤發(fā)生機(jī)制的研究提供了新的方向。 Sonichedgehog信號(hào)通路是人類胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化的重要信號(hào)通路。Sonichedgehog信號(hào)通路主要由分泌型信號(hào)糖蛋白Sonichedgehog(Shh)配體、跨膜蛋白受體patched(Ptc)和另一跨膜蛋白smoothened(Smo)組成的復(fù)合物，以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)組成。近年來，研究發(fā)現(xiàn)人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Sonic

4、hedgehog信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)。如在基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、髓母細(xì)胞瘤、胃癌、食道癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)Sonichedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵成員的突變或異常表達(dá)。同樣在結(jié)直腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)了Sonichedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵成員Shh、Ptc的高表達(dá)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示外源性Shh能促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，而抗Shh抗體能抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖。 綜觀以往

5、有關(guān)結(jié)直腸癌與Sonichedgehog信號(hào)通路異常激活的研究，均著重于對(duì)Shh配體的作用研究，對(duì)于Sonichedgehog信號(hào)通路中其它成員的研究較少。Smo蛋白是Sonichedgehog信號(hào)通路的關(guān)鍵成員，對(duì)信號(hào)通路具有激活作用。有關(guān)Smo基因在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用，目前尚未見研究報(bào)道。 本課題擬應(yīng)用Westernblot及半定量RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞內(nèi)Smo基因的表達(dá)水平，探討Smo基因與結(jié)直腸癌的關(guān)

6、系，再應(yīng)用RNAi技術(shù)通過轉(zhuǎn)染體外合成的特導(dǎo)性SmosiRNA進(jìn)入Lovo細(xì)胞內(nèi)降解Lovo細(xì)胞內(nèi)的SmomRNA表達(dá)，最后應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測SmomRNA被降解后Lovo細(xì)胞增殖水平與凋亡水平的變化，探討Smo基因在結(jié)直腸癌中的作用。 目的: 探討Smo基因與結(jié)直腸癌的關(guān)系，以及Smo基因在結(jié)直腸癌中的作用，為Smo基因位點(diǎn)上阻斷Sonichedgehog信號(hào)通路靶向治療結(jié)直腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與

7、方法: 1、細(xì)胞來源：本實(shí)驗(yàn)所使用的結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞株購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：總RNA提取試劑異硫氰酸胍(Trizol)、RT-PCR.試劑盒(FSK-100)、兔抗人Smo濃縮型多克隆抗體0.1ml、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體(二抗)、碘化丙啶(PI)、Annexin-V凋亡檢測試劑盒、MTT等。主要設(shè)備：CO2恒溫孵育箱、EpicsAltra型流式細(xì)胞儀、PCR擴(kuò)增儀、DYY-40B轉(zhuǎn)印電印電泳槽、DYY-

8、B型電泳儀。 2、實(shí)驗(yàn)方法：(1)Lovo細(xì)胞株于含10％胎牛血清、1％鏈霉素、青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度；(2)半定量RT-PCR測定結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞的SmomRNA表達(dá)；(3)Westernblot印跡檢測結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞的Smo蛋白表達(dá)；(4)設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成3對(duì)SmosiRNA：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1對(duì)非特異性siRNA；(5)將

9、Lovo細(xì)胞分成A、B、C、D、E五組：A組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-1組，B組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-2組、C組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-3組，D組為陽性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)，E組為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染時(shí)只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。(6)利用陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式分別將SmosiRNA轉(zhuǎn)染入各組Lovo細(xì)胞內(nèi)；(7)半定量RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)各組Lovo細(xì)胞的SmomRNA表達(dá)，比

10、較3對(duì)SmosiRNA抑制Lovo細(xì)胞SmomRNA表達(dá)的效果，篩選出抑制Lovo細(xì)胞SmomRNA表達(dá)最有效的siRNA，后繼實(shí)驗(yàn)中均以該特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組：(8)再將Lovo細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(9)MTT法檢測轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h、48h、72h各組Lovo細(xì)胞的增殖水平；(10)流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48h后各組Lovo細(xì)胞的凋亡率。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有

11、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn)染后不同組Smo基因mRNA水平的比較用完全隨機(jī)資料方差分析(One-wayANOVA)，不同時(shí)間點(diǎn)不同組Lovo細(xì)胞增殖水平的比較用重復(fù)測量方差分析，若P<0.05組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，則進(jìn)一步行LSD多重比較。不同組細(xì)胞凋亡率比較用獨(dú)立樣本率的χ2檢驗(yàn)。 結(jié)果: 1、Westernblot及半定量RT-PCR檢測結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞內(nèi)Smo蛋白及SmomRNA的表達(dá)水平，

12、結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺癌Lovo細(xì)胞內(nèi)有Smo蛋白及SmomRNA的高表達(dá)。 2、轉(zhuǎn)染48h后，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組及陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組的Lovo細(xì)胞的SmomRNA表達(dá)水平有顯著性差異(F=891.496，P<0.001)，siRNA-1組SmomRNA表達(dá)水平最低，siRNA-2組次之，兩組分別與陰性對(duì)照組比較，差異均有顯著性(P<0.001)；而siRNA-3組、陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差異

13、無顯著性(P>0.05)；siRNA-1組與siRNA-2組比較，差異亦有顯著性(P<0.001)。siRNA-1組、siRNA-2組的抑制率分別為63.56％、46.54％，siRNA-3組無抑制作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇siRNA-1轉(zhuǎn)染Lovo細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。 3、于轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72h不同時(shí)間點(diǎn)，siRNA-1組、陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組的Lovo細(xì)胞的增殖水平有顯著性差異(F=359.299，P<0.001)，s

14、iRNA-1組Lovo細(xì)胞的增殖水平在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。 4、于轉(zhuǎn)染48h后，siRNA-1組、陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組的Lovo細(xì)胞的凋亡率分別為21.7％、10.1％、4.4％，siRNA-1組細(xì)胞凋亡率較陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義χ2=15.909，P<0.001) 結(jié)論: (一)結(jié)腸腺癌的發(fā)生與Smo基因的高表達(dá)有關(guān)。 (二)Smo基因的高表達(dá)與