醛糖還原酶(AR)對TGF-β1誘導人系膜細胞(HMC)表達Fibronextin的影響及其機制的研究.pdf

1、腎小球硬化是各種原因所致腎小球損傷和病變的共同結局,是由多種生物活性物質和多種細胞成分參與的一個復雜病理過程,其主要的病理特征之一是腎小球內細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)的異常沉積。研究認為ECM合成和(或)降解失衡是腎小球硬化發(fā)生的重要機制之一,而系膜細胞(Mesangial Cell,MsC)增生則是許多腎小球疾病發(fā)生發(fā)展過程中的中心環(huán)節(jié),并且在腎小球內ECM代謝及調控過程中起重要作用,體內外各種生長

2、因子和細胞因子均可刺激MsC增殖。因此,研究腎小球系膜細胞與腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展之間的相互關系也是近年來器官纖維化研究領域的重要研究內容之一。
　　 MsC是腎小球內固有的一種血管外周細胞,大量研究證實,該細胞可自分泌多種細胞因子:如血小板源生長因子、IL-6、TGF-β1、內皮素1等,后者可促進MsC自身分裂、增生及細胞外基質的合成和分泌,在腎小球硬化過程中發(fā)揮重要作用。研究已證實,腎臟MsC高表達轉化生長因子β1(tran

3、sforming growth factorβ1,TGF-β1),TGF-β1是一個多功能細胞因子,具有調節(jié)細胞增殖、分化以及細胞凋亡等功能。TGF-β1具有調節(jié)ECM合成、代謝過程的作用,可以直接促進ECM成分的合成或影響ECM合成和(或)降解主要調節(jié)酶系統(tǒng)的活性而促進ECM合成增加和沉積,從而在腎小球硬化發(fā)生與發(fā)展的病理過程中具有重要的作用。
　　 醛糖還原酶(Aldose Reductase,AR)為NADPH依賴性醛-酮

4、還原酶家族成員之一,是多元醇代謝通路中的限速酶,可催化己糖或戊糖的NADPH依賴性還原反應,使之變成相應的糖醇或多元醇。AR廣泛分布于神經、肌肉、腦、腎臟、胎盤、血管、視網膜等組織中,在不同組織中的分子構成、免疫原性及其他理化性質有差別。對AR的研究,以往都集中在糖尿病及其并發(fā)癥中,但新近的研究發(fā)現(xiàn),AR的某些功能和高糖環(huán)境并不相關。我們課題組前期通過SSH-PCR研究發(fā)現(xiàn),AR是大鼠MsC中TGF-β1相關反應性基因之一,而TGF-β

5、1在組織纖維化,特別是腎臟纖維化中起著重要作用,因此AR是否參與了TGF-β1在非高糖狀態(tài)下所導致的腎小球硬化、腎臟纖維化及其病理過程值得深入研究。
　　 纖連蛋白(Fibronectin,FN)是構成細胞外基質的一個重要組成部分,是一種大分子糖蛋白,在正常組織中分布廣泛,具有促進細胞移動、分化、調理吞噬等功能,在細胞與細胞、細胞與基質的相互作用中起著重要作用。FN可誘導成纖維細胞增生,產生膠原纖維,促進纖維化的形成,研究發(fā)現(xiàn)F

6、N的合成及降解的異常在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起很大的作用。
　　 本課題采用細胞培養(yǎng)、基因轉染、免疫熒光、RNA干擾、RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot等實驗方法,觀察AR在人系膜細胞中的表達及其與TGF-β1的相互關系,觀察AR在TGF-β誘導Fibronectin表達增高過程中的作用,并初步探討這種作用所涉及的細胞信號傳導通路等作用機制,以明確AR在腎小球硬化等病理過程中的作用及意義,進一步認

7、識和了解AR在非糖尿病性腎臟疾病(主要為腎小球腎炎、纖維化和硬化)中的新作用,以期能夠為腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的病理機制的認識提供新的實驗依據。
　　 第一部分TGF-β1對人系膜細胞表達AR、FN以及MAPKs信號通路的影響
　　 目的：探討外源性TGF-β1對體外培養(yǎng)人系膜細胞(HMC)表達AR、FN以及對MAPKs信號通路的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,在培養(yǎng)液中添加外源性TGF-β1因子,采用免疫熒光和We

8、stern Blot方法觀察HMC內AR、FN和MAPKs表達的變化。
　　 結果：以不同濃度TGF-β1(1-10ng/ml)刺激HMC24h,結果發(fā)現(xiàn)AR和FN表達均增高,其中以1ng/mlTGF-β1作用濃度下AR、FN表達升高最為明顯(P＜0.05);再以1ng/mlTGF-β1以不同的作用時間(0-4h)刺激HMC,可見AR、FN在15min時表達即開始增高,其中AR表達在TGF-β1作用后1h升高最明顯(P＜0.05

9、),FN在2h升高最明顯(P＜0.05)。與此同時,TGF-β1激活了MAPKs信號通路,TGF-β1作用15min后可見磷酸化的ERK、INK和p38表達升高,其中磷酸化的ERK、INK在作用后30min達高峰,磷酸化的p38在1h后達高峰(P＜0.05),然后逐漸下降;磷酸化的ERK表達量和持續(xù)時間明顯多于磷酸化JNK和p38。
　　 小結：外源性TGF-β1可上調HMC內AR、FN的表達;TGF-β1可以活化MAPKs信號

10、通路,其中以ERK信號通路活化效果最明顯,提示TGF-β1上調AR、FN的表達可能與激活MAPKs信號通路有關,ERK信號通路在這過程中可能起著主要的作用。TGF-β1可調節(jié)AR表達的實驗結果也證實了在HMC內,AR也是TGF-β1的反應性基因。
　　 第二部分抑制AR活性,阻斷MAPKs和PKC信號通路對TGF-β1誘導FN表達的影響
　　 目的：探討AR抑制劑Zopolrestat和Sorbinil,MAPKs信號通

11、路抑制劑U0126(ERK抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)和G(o)6983(PKC抑制劑)對體外培養(yǎng)的HMC使用TGF-β1誘導FN表達的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,通過預先在培養(yǎng)液中分別添加AR抑制劑Zopolrestat和Sorbinil,MAPKs信號通路抑制劑U0126、SB203580、SP600125和PKC信號通路抑制劑G(o)6983作用后,再用外源性TGF-β1

12、因子刺激,采用WesternBlot方法觀察HMC內FN表達的變化。
　　 結果：僅使用AR抑制劑Zopolrestat和Sorbirtil作用于HMC,與未使用AR抑制劑的HMC相比,FN的表達未見減少;但在使用Zopolrestat和Sorbinil預孵育HMC后,再用TGF-β1刺激,則可發(fā)現(xiàn)FN的表達明顯減少(P＜0.05),使用Zopolrestat預作用組FN的表達比單獨使用TGF-β1刺激時減少了2.9倍,使用So

13、rbinil預作用組的FN的表達減少了2.5倍:分別以不同濃度的ERK、p38、JNK和PKC信號通路抑制劑作用于HMC,與正常對照組相比,FN的表達未見減少。進一步研究發(fā)現(xiàn),在預先使用ERK、p38、JNK和PKC抑制劑作用于細胞后,再用外源性TGF-β1刺激,則發(fā)現(xiàn)FN的表達明顯減少(P＜0.05),ERK、p38、JNK和PKC抑制劑預作用HMC組中的FN表達分別減少了2倍、1.6倍、1.8倍和2.4倍;預先使用Zopolrest

14、at孵育,再用ERK、p38、JNK和PKC通路抑制劑作用,最后使用TGF-β1刺激,結果發(fā)現(xiàn)ERK、JNK和PKC抑制劑使FN的表達分別減少2.3倍、2.4倍和2.1倍(P＜0.05)。但AR抑制劑和p38通路抑制劑合用后,與對照組比較,FN的表達未減少。
　　 小結：在無TGF-β1刺激時,單獨使用AR抑制劑(Zopolrestat和Sorbinil),或者單獨使用MAPKs和PKC信號通路抑制劑并不能減少HMC內FN的表達

15、,但在使用AR抑制劑,或者ERK、JNK、p38和PKC信號通路抑制劑預作用HMC后,再以TGF-β1刺激時,則能明顯減少細胞內FN的表達。說明AR、ERK、JNK、p38和PKC信號通路參與了TGF-β1誘導的FN表達過程的調控。以AR抑制劑和ERK、JNK和PKC通路抑制劑共同預作用HMC后,FN的表達明顯減少,尤其是ERK和JNK通路更加明顯,證明AR,ERK和JNK通路對TGF-β1誘導FN的表達過程可能存在疊加作用,也初步證明

16、AR對TGF-β1誘導FN的表達過程的調控作用可能通過ERK、JNK和PKC通路實現(xiàn)的。AR抑制劑和p38信號通路抑制劑共同作用后,TGF-β1誘導FN的表達并未減少,推測其原因可能為AR對HMC的作用與p38信號通路的作用相互拮抗,但具體機制不清楚,有待進一步研究。提示在HMC內TGF-β1誘導的MAPKs信號通路活化過程中,ERK、JNK與p38信號通路的作用存在著一定的差異。同時AR抑制劑必須在TGF-β1刺激的情況下才能發(fā)揮對F

17、N表達的調控作用,也更進一步的證明了在HMC中AR為TGF-β1的反應性基因。
　　 第三部分醛糖還原酶基因對TGF-β1誘導FN的表達及對MAPKs信號通路的影響
　　 目的：進一步證明醛糖還原酶基因在TGF-β1誘導的FN表達過程中的作用及對MAPKs信號通路的影響。
　　 方法：培養(yǎng)HMC,轉染PcDNA3.0-AR至HMC內及用RNA干擾技術干擾HMC內AR基因表達,觀察HMC表達AR、FN以及MAPKs

18、通路變化情況;轉染和干擾AR基因后的細胞預先使用MAPKs、PKC信號通路抑制劑作用,再用外源性TGF-β1刺激;采用免疫熒光、Western Blot、RT-PCR、Real-Time PCR方法觀察HMC內AR、FN和MAPKs信號通路的表達情況。
　　 結果：成功轉染和干擾HMC內AR基因,并經多種方法驗證轉染和干擾效果明顯。轉染AR基因后,與正常對照相比,HMC內AR蛋白表達增高了4.3倍,FN蛋白表達增高2.5倍(P＜

19、0.05);轉染AR基因的HMC再經TGF-β1刺激后,FN表達增加更為明顯(為對照組的3.6倍,P＜0.05);RNA干擾AR基因后,HMC中AR和FN表達明顯減少(P＜0.05),干擾后AR表達在蛋白水平減少了6.8倍,FN表達減少了16.2倍(P＜0.05);RNA干擾后的HMC再用TGF-β1刺激,與對照組比較,FN的表達減少8.1倍(P＜0.05),和單純干擾組比較有所上升,但卻明顯低于未干擾組;轉染PcDNA3.0-AR后,

20、使用免疫熒光方法檢測,與正常對照組比較,系膜細胞內AR和FN熒光表達明顯增強;通過RT-PCR、Real-TimePCR驗證,AR在mRNA水平增多與對照組相比超過10倍以上。在AR轉染組HMC中使用MAPKs、PKC信號通路抑制劑預孵育后,再用TGF-β1刺激,發(fā)現(xiàn)FN表達減少(P＜0.05),但與未轉染AR基因的細胞相比,FN減少的程度明顯降低,說明AR活性增高對MAPKs、PKC信號通路活性有一定的影響。在使用RNA干擾AR基因后

21、的系膜細胞用免疫熒光檢測,與正常對照組比較,細胞內AR和FN熒光表達明顯減弱,通過RT-PCR、Real-TimePCR驗證,AR在mRNA水平與對照組相比減少超過了80％;進一步實驗在RNA干擾AR基因的細胞,預先使用MAPKs、PKC通路抑制劑孵育后,再用TGF-β1刺激,結果發(fā)現(xiàn)FN表達明顯減少(P＜0.05),與未受RNA干擾的細胞相比,FN表達減少的程度明顯加重,且干擾后MAPKs信號通路的磷酸化水平明顯受到抑制,包括磷酸化的

22、ERK、p38和JNK表達均明顯減少,更進一步的證明了AR基因參與了TGF-β1誘導的MAPKs通路的活化過程。
　　 小結：轉染PcDNA3.0-AR后,即使在無TGF-β1刺激的情況下,FN的表達也明顯增多,TGF-β1刺激后FN的表達增多更加明顯。用RNA干擾技術干擾AR基因后,即使無TGF-β1的刺激,FN的表達也明顯的減少,說明改變HMC內AR基因表達的變化本身可以影響FN表達。在TGF-β1刺激時,轉染和干擾AR基因

23、對FN表達具有明顯的影響,進一步說明了AR參與了TGF-β1誘導的FN的調控過程,轉染AR基因后用MAPKs、PKC信號通路抑制劑孵育,再用TGF-β1刺激,與未轉染AR基因的細胞相比,FN減少的程度明顯降低;在RNA干擾AR基因的細胞,預先使用MAPKs、PKC通路抑制劑,再用TGF-β1刺激,與未受RNA干擾的細胞相比,FN表達減少程度明顯加重,進一步的說明AR對MAPKs,PKC信號通路的活性存在一定的影響;干擾AR基因后,MAP

24、Ks信號通路的活性也明顯受到抑制,證明了TGF-β1誘導的MAPKs信號通路的活化過程與AR的活性狀態(tài)有關。
　　 結論：
　　 1.外源性TGF-β1可上調HMC內AR、FN的表達,提示在HMC內,AR仍然是TGF-β1的下游反應性基因之一,這也進一步證明了課題組前期研究結果。TGF-β1在增加AR、FN表達的同時激活了包括ERK、p38和JNK信號通路,其中ERK信號通路活化效果最明顯,說明TGF-β1對人系膜細胞內

25、FN的表達的調控作用,可能與TGF-β1刺激活化了ERK、p38和JNK信號通路有關,ERK信號通路可能起著重要作用。
　　 2.在無外源性TGF-β1刺激的情況下,單獨使用AR抑制劑或者單獨使用MAPKs和PKC信號通路抑制劑并不能減少HMC內FN的表達。但在TGF-β1刺激下,AR抑制劑、MAPKs和PKC信號通路抑制劑能明顯的減少HMC內FN的表達,說明AR參與了TGF-β1誘導FN高表達的調控過程,且這一過程可能與MAP

26、Ks和PKC信號通路有關。AR抑制劑必須在TGF-β1刺激的情況下才能發(fā)揮對FN表達的調控作用,也更進一步的證明了AR為TGF-β1的反應性基因。
　　 3.轉染PcDNA3.0-AR后,即使在無TGF-β1刺激的情況下,FN的表達也明顯增多,添加TGF-β1刺激后FN的表達增多更加明顯。用RNA干擾AR基因后,在無TGF-β1刺激的情況下,FN的表達也明顯的減少,說明AR本身也參與了HMC內FN的表達調控作用。在TGF-β1刺

27、激時,轉染和干擾AR基因對FN表達有更加明顯的影響,轉染后使FN的表達增多更明顯,干擾后FN的表達減少也更顯著,進一步說明了AR參與了TGF-β1誘導的FN的調控過程。在轉染AR基因后的細胞,用MAPKs和PKC信號通路抑制劑作用,FN的減少程度不如未轉染的細胞,進一步的說明AR對MAPKs,PKC信號通路的活性存在一定的影響,高表達AR能夠削弱通路抑制劑對信號通路的抑制作用;干擾AR基因后,MAPKs信號通路的活性也明顯受到抑制,證明