螺內(nèi)酯對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及TGF-β1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察螺內(nèi)酯(Spironolactone,SPI)對(duì)醛固酮(Aldosterone,ALD)誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞( Mesangial cells, MCs)氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達(dá)的影響,探討ALD致糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)及SPI腎保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠MCs,隨機(jī)分組如下:

2、
　　①NC組:正常對(duì)照組(低糖DMEM培養(yǎng)液,葡萄糖濃度為5.6mmol/L);
　?、贏LD組:醛固酮刺激組：
　　ALD1組:低糖DMEM培養(yǎng)液中加入醛固酮(10-5mol/L)刺激;ALD2組:低糖DMEM培養(yǎng)液中加入醛固酮(10-7mol/L)刺激;ALD3組:低糖DMEM培養(yǎng)液中加入醛固酮(10-9mol/L)刺激。
　?、跾PI組:螺內(nèi)酯干預(yù)組：
　　SPI1組:醛固酮(10-7mol/L)刺

3、激的同時(shí)加入螺內(nèi)酯(10-7mol/L)干預(yù);SPI2組:醛固酮(10-7mol/L)刺激的同時(shí)加入螺內(nèi)酯(10-8mol/L)干預(yù);SPI3組:醛固酮(10-7mol/L)刺激的同時(shí)加入螺內(nèi)酯(10-9mol/L)干預(yù)。48小時(shí)后分別收集細(xì)胞及上清液。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain

4、reaction,RT-RCR)方法檢測(cè)細(xì)胞TGFβ-1、醛固酮合成酶(CYP11B2)、醛固酮受體( Mineralocorticoid receptor, MR)和11β-羥類固醇脫氫酶2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase2,11β-HSD2)mRNA表達(dá);ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1蛋白濃度。
　

5、　結(jié)果：1.RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示MCs表達(dá)CYP11B2、MR和11β-HSD2 mRNA;
　　2.ALD對(duì)腎小球MCs內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響：
　　ALD刺激MCs48h后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加,ALD1,2,3組分別為(21.77±0.87)、(17.33±0.49)、(15.25±0.63),組間差異顯著,P＜0.01;與NC組(4.28±0.50)相比,差異顯著(P均＜0.01)。
　　3.ALD對(duì)腎小

6、球MCs TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌的影響：
　　半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),NC組系膜細(xì)胞可低水平表達(dá) TGFβ-1 mRNA(1.22±0.14)及蛋白(0.78±0.12ng/ml)。ALD作用48 h后,TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌顯著增加,兩指標(biāo)在不同濃度ALD組之間分別比較,組間差異顯著(P均＜0.05)。
　　4.螺內(nèi)酯對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的腎小球MCs內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響：
　　醛固酮(10-7

7、mol/L)刺激的同時(shí)加入螺內(nèi)酯干預(yù)后,SPI1,2,3組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低,分別為(7.34±0.89)、(9.25±0.65)、(10.9±0.97),組間差異顯著,P＜0.01;與ALD2組(17.33±0.49)相比,差異顯著(P均＜0.05)。SPI1組ROS水平稍高于NC組,差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　5.SPI對(duì)ALD誘導(dǎo)的腎小球MCs TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌的影響：
　　醛固酮(1

8、0-7mol/L)刺激的同時(shí)加入螺內(nèi)酯干預(yù)后,SPI1,2,3組MCs TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌均較ALD2組顯著下降(P＜0.01或0.05),兩指標(biāo)分別進(jìn)行組間比較,差異具有顯著性(P均＜0.05)。
　　6.腎小球MCs ROS產(chǎn)生和TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌的相關(guān)性分析：
　　MCs產(chǎn)生的ROS和TGFβ-1 mRNA表達(dá)及蛋白分泌分別呈正相關(guān)(r=0.866, P＜0.01;r=0.823,P