山芝麻酸甲酯對PDGF-BB刺激的肝星狀細胞ERK信號通路的影響.pdf

1、目的:細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)作為可以轉移至細胞核并激活轉錄因子的蛋白激酶，是眾多信號通路的“瓶頸”和匯集點。近年來發(fā)現(xiàn)抑制ERK信號通路，從而抑制HSCs活化與增殖，是目前治療肝纖維化比較理想的選擇。本實驗通過檢測山芝麻酸甲酯(methyl helicterate，MH)對ERK信號通路上游靶位Raf、ERK1/2的表達及其磷酸化水平的影響和對轉錄因子c-

2、fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達的影響，探討其體外抗肝纖維化的分子機制。
　　方法:HSC-T6、LX2和7702選為本實驗采用的肝星狀細胞，體外培養(yǎng)。用不同濃度MH作用于細胞，CCK-8試劑盒法檢測MH對細胞的毒性作用;10 ng/mL PDGF-BB，50μM PD98059及MH作用于細胞后，CCK-8試劑盒法、LDH法、劃痕實驗、集落生成法、AO-EB染色和AnnexinⅤ-FITC/PI分別觀察細胞增殖、L

3、DH活力、遷移、集落形成、凋亡及細胞周期;RT-PCR法觀察ERK1、ERK2、Raf、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1 mRNA的表達;Western bolt免疫印跡法觀察細胞ERK1/2、p-ERK1/2和Raf、p-Raf的表達。免疫組化法觀察細胞c-fos、c-jun、c-myc、Ets-1和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Col-Ⅲ的表達。
　　結果:
　　(1) MH對PDGF誘導的細胞增殖、LDH活性、

4、遷移、集落形成、凋亡及細胞周期的影響
　　實驗結果發(fā)現(xiàn)，外源性刺激因子PDGF-BB刺激的模型組與正常對照組比較，細胞在24 h處增殖明顯，差異有統(tǒng)計學意義;12.5、25、50μg/mL的MH作用組與刺激組比較均能抑制細胞增殖，呈濃度依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。與正常組比較，PDGF-BB刺激組細胞增殖明顯增強、LDH活性明顯減弱(P＜0.01)，細胞遷移及集落生成分別加快、增多，細胞形態(tài)學、細胞凋亡率和細胞周期均無明

5、顯改變;經(jīng)藥物干預后，PD98059和MHL、MHM、MHH能明顯抑制細胞增殖、遷移及集落的生成，提高LDH活性，此外，還引起細胞形態(tài)學發(fā)生變化，提高細胞的凋亡率，誘導細胞阻滯于G2期(P＜0.05或P＜0.01)。以上結果表明，MH能明顯抑制肝星狀細胞的增殖、遷移及集落的生成，并促進其凋亡。因而，證實了MH抗肝纖維化的調(diào)控機制與抑制肝星狀細胞的增殖有關，為其靶向防御肝纖維化提供了實驗依據(jù)和理論支持。
　　(2) MH對PDGF誘

6、導的細胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達的影響
　　免疫組化結果顯示，與正常組比較，PDGF刺激組細胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多，Col-Ⅰ含量升高。經(jīng)藥物干預后，PD98059和MHL、MHM、MHH能顯著抑制Col-Ⅲ的合成和分泌，降低Col-Ⅰ含量。結果提示，MH抗肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與其抑制肝星狀細胞膠原的合成與沉積密切相關。
　　(3)MH對PDGF誘導的細胞信號通路上游靶位Raf以及ERK1/2的表達及其磷酸化水平的影

7、響
　　實時熒光定量PCR實驗結果表明，PDGF可顯著上調(diào)肝星狀細胞Raf以及ERK1/2 mRNA的表達(P＜0.01)。Western Blot結果顯示，PDGF刺激組細胞Raf、p-Raf以及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達明顯增（P＜0.01）。經(jīng)藥物干預后，PD98059與MH均能顯著下調(diào)細胞Raf、ERK1/2 mRNA和Raf、p-Raf及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01)。

8、可見，MH能顯著抑制肝星狀細胞Raf及ERK1/2的表達和磷酸化水平，降低上游靶位ERK的活性，對ERK信號通路有明顯的抑制作用。
　　(4)MH對PDGF誘導的細胞轉錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達的影響
　　實時熒光定量PCR實驗結果顯示，PDGF刺激組細胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 mRNA表達明顯高于正常組(P＜0.01)。經(jīng)藥物干預后，PD98059與MH均能顯著下調(diào)細胞

9、c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 mRNA水(P＜0.05或P＜0.01)。免疫細胞化學染色結果，顯示細胞質內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細胞增多濃染。經(jīng)藥物干預后，PD98059與MH細胞質內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細胞數(shù)減少淡染。這表明，MH能抑制細胞轉錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達，其能抑制ERK活化，阻滯了ERK通路信號傳導。