基于TGF-β-Smads、ERK信號通路探討委陵菜酸抑制肝星狀細胞的作用及其機制.pdf

1、目的:
　　肝纖維化是慢性肝損傷后的一種自我修復(fù)方式，其特征是細胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)的大量沉積。研究表明，TGF-β/Smads和ERK信號通路存在共同的信號傳導(dǎo)交匯點Smad4，它們在腫瘤的發(fā)生過程中可在多個層次發(fā)生串話(Cross-talk)而發(fā)揮重要、復(fù)雜的重要作用。但這兩信號通路在肝纖維化發(fā)生過程中是否存在Cross-talk作用仍不清楚。深入揭示這兩條通路在肝細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)系，尋找有效的信號通路調(diào)控靶點，對

2、于有效控制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展將具有重要的意義。
　　委陵菜酸(Tormentic acid，TA)是從薔薇科植物委陵菜（Potentillachinensis Ser.）全草中分離得到一個活性成分。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TA對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷有明顯的保護作用，但其對慢性肝病尤其是肝纖維化的作用仍不清楚。
　　因此，本實驗首先采用shRNA技術(shù)沉默Smad4基因的表達，探討在肝纖維形成過程中TGF-β/Smads和

3、ERK通路的Cross-talk作用。其次，研究TA對肝星狀細胞的抑制作用，并以TGF-β/Smads、ERK信號通路為切入點探討其作用機制。
　　方法:
　　1.TGF-β/Smads和ERK通路在肝星狀細胞中的交互作用
　　先通過對NCBI數(shù)據(jù)庫的檢索，獲得大鼠Smad4基因mRNA序列，由軟件輔助設(shè)計出三條Smad4 shRNA序列，同時合成非特異性序列作為陰性對照。本實驗構(gòu)建以慢病毒為載體的Smad4 shRN

4、A，選擇感染復(fù)數(shù)(MOI)值為10、20、30、40、50、60、70、80的病毒分別感染到大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)，確定最佳的MOI值后，轉(zhuǎn)染細胞，通過qRT-PCR法檢測Smad4mRNA的水平，篩選出抑制率最高的RNAi序列作為后續(xù)實驗。同時，采用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。
　　后續(xù)實驗設(shè)三個組:正常對照組（Control組）、轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組(NC組)、沉默Smad4基因組（shRNA-Smad4組）。C

5、CK-8法檢測24、48、72 h細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期;qRT-PCR法檢測Smad4、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)、MAPK激酶2(MEK2)mRNA的水平;免疫細胞化學(xué)法檢測Ⅰ型膠原(Col-I)、Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)蛋白的表達;Westem blot法檢測Smad4、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1

6、/2)蛋白表達。
　　2.委陵菜酸對HSC-T6細胞的作用
　　采用CCK-8法檢測委陵菜酸對HSC-T6細胞的半數(shù)抑制率(IC50)，隨后將細胞分為6組:正常對照組，PDGF-BB刺激組，抑制劑組(PD98059組)，委陵菜酸高、中、低劑量組（TAH、TAM和TAL組）。利用姬姆薩染色液、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒分別檢測TA對細胞集落形成、凋亡及周期的影響;qRT-PCR法檢測

7、ERK2、MEK2 mRNA的水平;免疫細胞化學(xué)法檢測Col-Ⅲ蛋白的表達;Westem blot法檢測Smad4、α-SMA、c-Raf、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β/Smads和ERK通路在HSCs中的交互作用
　　(1)沉默Smad4基因?qū)毎鲋臣爸芷诘挠绊?br>　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當MOI值為30時，細胞的轉(zhuǎn)染效率達到90％且細胞狀態(tài)好，故選用其作為感染值。感染成功

8、后，qRT-PCR結(jié)果顯示，shRNA序列為AGACAGAGCATCAAAGAAA對Smad4基因的抑制效率最高，為75.785％，可用其作為后續(xù)沉默Smad4基因的序列。
　　細胞增殖結(jié)果顯示，與NC組比較，shRNA-Smad4組細胞在24、48及72 h生長緩慢。細胞周期結(jié)果顯示，與NC組比較，shRNA-Smad4組S期細胞數(shù)增多，表明細胞被阻滯于S期。
　　(2)沉默Smad4基因?qū)Ζ?SMA及膠原形成的影響

9、>　　免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，shRNA-Smad4組與NC組比較，可見陽性表達顆粒明顯減少及棕色變淺，表明Col-I、Col-Ⅲ蛋白躲表達明顯減少;Western blot結(jié)果顯示，shRNA-Smad4組α-SMA表達顯著下降。
　　(3)沉默Smad4基因?qū)GF-β/Smads、ERK信號通路的影響
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組比較，shRNA-Smad4組中，Smad4、ERK1、ERK2、MEK2 mRNA

10、水平均降低;Western blot結(jié)果顯示，與NC組比較，shRNA-Smad4組Smad4蛋白表達明顯降低;shRNA-Smad4組p-ERK1/2與ERK1/2的比值稍下降。
　　2.TA對肝星狀細胞的抑制作用
　　(1) TA對HSC-T6細胞IC50
　　實驗結(jié)果顯示，TA能抑制HSC-T6細胞的增殖，且呈濃度依賴性。經(jīng)SPSS17.0計算出TA對HSC-T6細胞作用24 h的IC50為81.71μM。

11、>　　(2) TA對細胞集落形成的影響
　　實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，PDGF-BB可促進HSC-T6細胞集落的形成。藥物干預(yù)后，PD98059及TA高、中、低劑量組均能抑制HSC-T6細胞集落的生成，并且隨著藥物濃度的增加，抑制效果越明顯。
　　(3) TA對HSC-T6細胞凋亡及周期的影響
　　細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，經(jīng)PDGF-BB刺激后，HSC-T6細胞的總凋亡率有所下降，但差異無意義。與

12、刺激組比較，PD98059及TA中、低劑量組總凋亡率未見明顯改變。但經(jīng)TA高劑量組干預(yù)后，其總凋亡率明顯增加，表明TA可以促進HSC-T6細胞的凋亡(P＜0.05)。細胞周期檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，PDGF-BB對HSC-T6細胞周期影響無統(tǒng)計學(xué)差異，而TA高劑量作用后，明顯將細胞阻滯在G2期(P＜0.01)。
　　(4) TA對HSC-T6細胞α-SMA及膠原形成的影響
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與

13、刺激組比較，TA高、中、低劑量均能明顯降低α-SMA蛋白的表達(P＜0.05)。細胞免疫化學(xué)實驗結(jié)果顯示，與刺激組比較，PD98059組中Col-Ⅲ蛋白的表達明顯減少(P＜0.01);在TA高劑量組中可見陽性表達顆粒明顯減少及棕色變淺，表明TA高劑量對HSC-T6中Col-Ⅲ蛋白的表達有下調(diào)作用(P＜0.05)。
　　(5) TA對HSC-T6細胞TGF-β/Smads、ERK信號通路的影響
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與刺

14、激組比較，TA高劑量組中ERK2和MEK2mRNA的水平下降(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，TA高劑量組中Smad4、c-Raf的表達降低(P＜0.05)。與刺激組比較，PD98059組中p-ERK1/2與ERK1/2的比值顯著降(P＜0.01);經(jīng)TA作用后，p-ERK1/2與ERK1/2的比值稍下降。
　　結(jié)論:
　　1.TGF-β/Smads信號通路的阻斷會使ERK信號通路相關(guān)基因水平降低，提示TG