乙醛激活肝星狀細(xì)胞中Wnt與TGF-β信號(hào)通路的Crosstalk研究.pdf

1、目的:Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來(lái)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤研究中的一大熱點(diǎn),參與了胚胎發(fā)育及成體組織細(xì)胞增殖、分化及凋亡等調(diào)控過(guò)程。Wnt信號(hào)通路的異?；罨c腎、肺、肝、心臟以及皮膚等組織器官纖維化的發(fā)生與進(jìn)展關(guān)系密切。本研究采用肝星狀細(xì)胞株體外培養(yǎng),MTT,VG染色,ELISA,Western Blotting等檢測(cè)方法,探討Wnt與TGF-β信號(hào)通路在乙醛刺激肝星狀細(xì)胞活化中交叉對(duì)話(crosstalk)的可能機(jī)理,然后從肝星狀細(xì)

2、胞活化程度的角度觀察兩條通路crosstalk的功能效應(yīng)。首先,乙醛刺激HSC細(xì)胞株,通過(guò)VG染色法從形態(tài)學(xué)角度觀察HSC活化程度；MTT法檢測(cè)活化的HSC的增殖程度:ELISA法測(cè)定HSC內(nèi)膠原蛋白Ⅰ以及纖維粘連素FN含量,證明乙醛能有效刺激肝星狀細(xì)胞株活化。接著采用SB-431542特異性阻斷TGF-β信號(hào)通路,Westernblotting檢測(cè)Wnt信號(hào)通路下游產(chǎn)物β-catenin的磷酸化水平；TDZD-8特異性阻斷GSK-3β

3、,進(jìn)一步激活Wnt途徑,Westernbloting檢測(cè)TGF-β通路中Smad3的磷酸化狀態(tài)；同時(shí)使用SB-431542和TDZD-8檢測(cè)β-catenin以及Smad3的磷酸化,以分析兩通路可能存在的crosstalk。
　　 方法:(1)HSC-T6細(xì)胞株分為未處理組(陰性對(duì)照組),乙醛激活組(陽(yáng)性對(duì)照組),TDZD-8處理組(Wnt激活對(duì)照組),乙醛激活+FDZD-8處理組(Wnt激活組),乙醛激活+SB-431542處

4、理組(TGF-β通路抑制組,而Wnt途徑激活),乙醛激活+SB-431542+TDZD-8處理(Wnt途徑進(jìn)一步激活而TGF-β通路抑制)。各組細(xì)胞培養(yǎng)至融合度70％-80％時(shí),0.4％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理細(xì)胞12h后,更換為10％胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基。對(duì)照組用對(duì)應(yīng)的抑制劑處理培養(yǎng),刺激組在對(duì)應(yīng)的抑制劑預(yù)處理1h后給予乙醛刺激(終濃度200gmol/L)刺激,每12h補(bǔ)加一次,刺激24h。之后提取細(xì)胞總蛋白,G250法

5、測(cè)定蛋白含量,SDS-PAGE電泳分離,WesternBlotting檢測(cè)各目的蛋白含量,檢測(cè)指標(biāo)包括:Wnt途徑下游產(chǎn)物總β-catenin,磷酸化β-catenin,TGF-β途徑總smad3,磷酸化的p-smad3-S425,磷酸化的p-smad3-S204。根據(jù)Western印跡膜上蛋白條帶灰度,采用QuantityOne分析軟件進(jìn)行處理,對(duì)不同受體拮抗劑或激活劑作用后各蛋白磷酸化水平的改變進(jìn)行分析。(2)分組同(1),所有細(xì)胞

6、均在6孔板中爬片,細(xì)胞處理方案同(1),待處理完畢,將細(xì)胞爬片做VG染色,顯微鏡下觀察及照相。細(xì)胞培養(yǎng)上清液做ELISA檢測(cè)纖維粘連素FN和膠原蛋白Ⅰ含量變化。(3)將96孔板接種HSC-T6細(xì)胞株,分組同(1),每組設(shè)3復(fù)孔,細(xì)胞處理方法同(1),光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果:(1)乙醛激活HSC細(xì)胞株后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值活性明顯上升,ELISA檢測(cè)出纖維粘連素FN和膠原蛋白Ⅰ以及平滑肌動(dòng)蛋白

7、α-SMA含量均有不同程度的增多,VG染色示膠原含量增多,說(shuō)明酒精的代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)肝星狀細(xì)胞的活化有明顯的刺激作用。(2)使用Wnt途徑激活劑TDZD-8(GSK-3β特異性阻斷劑)激活Wnt途徑后,Wnt途徑下游產(chǎn)物β-catenin表達(dá)無(wú)明顯變化,但p-β-catenin水平下降；在另一組使用SB431542阻斷TGF-β通路,下游產(chǎn)物β-catenin無(wú)明顯變化,p-β-catenin水平也下降；使用TDZD-8和SB431542

8、同時(shí)阻斷TGF-β通路,激活Wnt途徑,β-catenin表達(dá)量無(wú)明顯變化,p-β-catenin水平明顯下降。(3)使用Wnt途徑激活劑TDZD-8(GSK-3p特異性阻斷劑)激活Wnt途徑后,TGF-β途徑的關(guān)鍵因子Smad3的S425和S204磷酸化水平并無(wú)明顯變化；使用SB431542阻斷TGF-β途徑后S425和S204表達(dá)都明顯降低；同時(shí)使用TDZD-8和SB431542,S425和S204水平降低但降幅不如單阻斷TGF-β

9、途徑。
　　 結(jié)論:(1)乙醛激活HSC細(xì)胞后,可以使HSC細(xì)胞進(jìn)一步活化,其分泌產(chǎn)物Ⅰ型膠原蛋白及纖維粘連素明顯增多,細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)分化。(2)在乙醛激活的肝星狀細(xì)胞中,TGF-β信號(hào)通路的抑制可導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的激活,因此TGF-β信號(hào)通路對(duì)Wnt信號(hào)通路具有抑制效應(yīng)。(3)乙醛可導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路激活,且Wnt與TGF-β兩條信號(hào)通路之間存在“crosstalk”,Wnt信號(hào)通路對(duì)Smad3的S425和S20